Capítulo 9-Diseño de un estudio metabolómico

¿Cuál es su objetivo de estudio?

La parte más importante de cualquier estudio metabolómico es definir el alcance del mismo. Se pueden utilizar dos enfoques: global o específico. Los enfoques globales, o metabolómicos no dirigidos, son semicuantitativos y tienen en cuenta todos los datos de metabolitos de salida, mientras que los estudios dirigidos utilizan paneles de metabolitos conocidos para cuantificar las cantidades de esos metabolitos específicos en la(s) muestra(s) de interés. El enfoque que elija, o si utiliza una combinación, depende de su pregunta de investigación.

Para quienes estén interesados en identificar nuevos biomarcadores o en comprender la presencia de un amplio conjunto de metabolitos, la metabolómica global es la mejor opción. Sin embargo, si sabe lo que está buscando y quiere saber qué cantidad de un metabolito específico o de grupos de metabolitos está presente en su muestra, necesitará un enfoque específico. En Metabolon, ofrecemos paneles específicos para aminoácidos, ácidos biliares, carbonos centrales, lípidos complejos, ácidos grasos, intolerancia a la glucosa, resistencia a la insulina, ácidos grasos de cadena corta, y mucho más. Y, por supuesto, podemos ayudarle a desarrollar paneles personalizados específicos para sus objetivos de investigación.

Debido a su naturaleza, los paneles dirigidos tienen necesariamente una cobertura analítica limitada en comparación con los paneles globales, pero son más sensibles y reproducibles que los enfoques no dirigidos. También puede ser difícil identificar compuestos desconocidos utilizando paneles globales, sobre todo debido a la limitada disponibilidad de estándares analíticos e información espectral en bases de datos públicas^.1 A menudo, los investigadores optan por un enfoque doble para obtener lo mejor de ambos mundos: comenzar con un enfoque global y luego utilizar la metabolómica dirigida para comprender mejor los analitos clave de interés.

Independientemente del enfoque o la combinación de enfoques que elija, es importante definir este parámetro del estudio desde el principio, ya que esto informará sobre los tipos de muestras y las cantidades necesarias para que la recogida de datos sea lo más sencilla posible.

¿Qué tecnología es mejor para su estudio?

Como ya se ha comentado brevemente en capítulos anteriores de esta guía, existen dos tecnologías principales para obtener datos sobre metabolitos: la resonancia magnética nuclear (RMN) y la cromatografía líquida-espectrometría de masas (CL-EM).

• RMN: La RMN expone las muestras a un campo magnético y a un pulso de radiofrecuencia para identificar compuestos basándose en la energía de resonancia de la radiación electromagnética absorbida y reemitida por los núcleos celulares. Específicamente para la metabolómica, se suelen analizar los átomos de protones de moléculas pequeñas (1H-NMR). Se trata de un método altamente reproducible capaz de medir entre decenas y cientos de metabolitos a partir de diversos tipos de muestras.
• LC-MS: Los espectrómetros de masas miden moléculas pequeñas ionizándolas (añadiéndoles carga) y detectándolas a medida que se desplazan por el espectrómetro. Mediante el uso de la cromatografía líquida (CL) para separar físicamente las moléculas presentes en una muestra antes de su ionización en el espectrómetro de masas, los investigadores pueden trabajar con muestras de muy pequeño tamaño (hasta 0,1 μL) que admite la CL para detectar miles de metabolitos a partir de diversos tipos de muestras^.2-5

Cada método tiene sus ventajas e inconvenientes. La principal ventaja de la RMN es que no es invasiva y no destruye la muestra^,6 lo que significa que puede reutilizar sus muestras para investigaciones experimentales adicionales (incluyendo LC-MS complementaria, si lo desea).

Las muestras no se destruyen durante la RMN porque, a diferencia de la LC-MS, esta tecnología no requiere ningún preprocesamiento o separación de la muestra antes de la identificación, lo que simplifica enormemente la preparación de la muestra para la RMN^.6 Además, la RMN es altamente reproducible y cuantitativa, ya que las intensidades de los picos electromagnéticos son directamente proporcionales al número de núcleos de la muestra.^{6 También es un potente método para identificar metabolitos desconocidos,6 lo que la convierte en una gran herramienta para el descubrimiento de nuevos biomarcadores.7}

Sin embargo, la LC-MS es un método mucho más sensible que la RMN y más adecuado para análisis metabolómicos específicos^.7 A diferencia de la RMN, la LC-MS puede medir miles de metabolitos a la vez y suele utilizarse para analizar diferentes clases de metabolitos de la misma muestra, con lo que se consigue una cobertura más amplia del metaboloma que con la RMN^.6 Las técnicas de EM disponibles en la actualidad son increíblemente sensibles y precisas y ofrecen una alta resolución de masas, lo que significa que más del 80% de las vías presentes en la base de datos KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pueden detectarse mediante este método^.1

¿Lo hace usted mismo o lo subcontrata?

Lo siguiente que hay que determinar antes incluso de empezar a recoger muestras es si el proyecto se ejecutará internamente o se subcontratará. Hacerse esta pregunta por adelantado puede ahorrarle mucho tiempo y dinero, y le ayudará a centrar adecuadamente sus objetivos de investigación teniendo en cuenta las limitaciones, riesgos y costes asociados a cada opción.

En la empresa

• Ventajas: no hay riesgo de que las muestras se pierdan o se dañen durante el transporte, se pueden empezar a procesar inmediatamente y se sabe exactamente cuándo se recibirán los datos.
• Contras: necesidad de adquirir o alquilar instrumental y acceso a software de análisis, necesidad de disponer de estándares de investigación y bibliotecas de referencia propios, necesidad de conocimientos técnicos para interpretar los datos con seguridad.

Aunque se pueden adquirir algunos kits para facilitar los proyectos de metabolómica internos, suelen ser semicuantitativos y, por tanto, no permiten realizar estudios específicos. Además, es posible que no tengan la mejor cobertura, lo que significa que podría perderse importantes descubrimientos científicos. A menos que vaya a realizar análisis metabolómicos con regularidad, la inversión financiera en instrumentos, software y personal formado en el manejo de las muestras, el funcionamiento de los instrumentos y el análisis de datos puede no merecer la pena.

Subcontratación

• Ventajas: acceso a expertos en metabolómica que analizan e interpretan los datos de metabolómica a diario, acceso a la mejor tecnología disponible para obtener la máxima precisión y confianza, métodos totalmente validados para garantizar la reproducibilidad y fiabilidad entre cohortes.
• Inconvenientes: puede no ser factible para análisis urgentes debido a los plazos de envío y de entrega de los datos este, el pago por servicio puede no estar al alcance de todos los proyectos o presupuestos

La externalización de sus estudios metabolómicos puede ser angustiosa, especialmente si está trabajando con muestras limitadas que son difíciles de obtener, por lo que es esencial que elija un socio metabolómico de confianza con experiencia en el que pueda contar. Metabolon ofrece varios modelos diferentes para trabajar con usted y satisfacer sus necesidades de investigación, desde el procesamiento de muestras y sólo datos hasta el análisis completo y la interpretación. Nuestros 20 años de experiencia optimizando protocolos y trabajando con cientos de tipos de muestras, combinados con nuestra biblioteca de referencia que contiene más de 5.400 metabolitos, significa que estamos totalmente equipados para ayudarle a diseñar su estudio, recoger las muestras adecuadas de la manera correcta y obtener datos de la mayor calidad posible con respuestas significativas y definitivas a sus preguntas de investigación.

Recogida, preparación, almacenamiento y envío de muestras

Como ya comentamos brevemente en el capítulo 4 de esta guía, se pueden analizar distintos tipos de muestras mediante protocolos metabolómicos, como células en cultivo, tejidos, heces, sangre, orina y sudor. La fuente de muestra que utilice dependerá de su objetivo de investigación; por ejemplo, seleccionará heces si desea estudiar el impacto del microbioma intestinal en la adquisición de nutrientes por parte del huésped, pero trabajará con muestras de tejido si desea identificar biomarcadores que diferencien tumores primarios y metástasis. Planificar con antelación le ayudará a trazar su presupuesto con antelación y evitar la necesidad inesperada de añadir más muestras más adelante o solicitar ampliaciones de financiación.

Cada tipo de muestra requiere una manipulación y preparación diferentes, que también dependen de si ha seleccionado un enfoque dirigido o no y de si utiliza RMN o LC-MS. Si está realizando su proyecto internamente, necesitará asegurarse de que sabe cómo manejar sus muestras adecuadamente; y para muestras particularmente difíciles, la subcontratación es a menudo la opción más fácil y barata, especialmente si está trabajando con material de muestra limitado. Con cada proyecto, Metabolon ofrece un kit de manipulación de muestras Study Success gratuito, personalizado específicamente para su estudio. Con el kit, incluimos tubos con códigos de barras específicos para su matriz (es decir, biofluidos, muestras sólidas o gránulos celulares) con instrucciones para enviarnos sus muestras por correo para garantizar que lleguen de forma segura. Si almacena grandes cantidades de muestras en un biorrepositorio o biobanco, incluso trabajaremos directamente con el personal para preparar y enviar sus muestras.

Interpretación de datos

La interpretación de los datos suele ser la parte más difícil de cualquier proyecto de metabolómica. Los instrumentos no producen resúmenes fáciles de leer con bellos gráficos; en su lugar, se obtienen tablas con infinitas columnas y valores que usted debe transformar en ideas comprensibles utilizando cualquiera de las numerosas herramientas de software disponibles (algunas de las cuales son gratuitas, otras no). Si nadie de su equipo está formado en el análisis de datos de RMN o LC-MS, es posible que no confíe en su interpretación y la probabilidad de pasar por alto observaciones importantes y procesables es alta. Externalizar el análisis y la interpretación de los datos puede ahorrarle mucho tiempo y dinero y evitarle tener que rehacer los experimentos.

Trabajando con Metabolon, nunca se quedará a oscuras cuando interprete sus datos. Los paneles globales vienen con acceso continuo al PortalMyMetabolon , donde puede acceder a la interpretación personalizada de nuestros directores de estudio con nivel de doctorado, las pruebas estadísticas que realizaron y las visualizaciones de datos totalmente personalizables. Y aunque los paneles específicos no tienen el mismo análisis estadístico y visualización que los paneles globales, proporcionamos una tabla de datos formateada que está lista para la importación y el análisis con herramientas de terceros como R y Python.

Para aquellos grupos de investigación que deseen subcontratar la identificación y cuantificación de metabolitos pero no la interpretación de datos, también ofrecemos el servicio de sólo datos. Esta puede ser una buena opción para los laboratorios con la experiencia necesaria para el análisis de datos, pero que no necesariamente tienen acceso o fondos para la instrumentación adecuada o que están trabajando con tipos de muestras fuera de su experiencia.

¿Y ahora qué?

Después de leer esta guía, estará listo para empezar a realizar sus propios estudios metabolómicos y experimentar la potencia científica que ofrecen. Estamos aquí para ayudarle en su viaje, tanto si sólo necesita que procesemos sus muestras como si desea trabajar con nosotros de principio a fin en el diseño y la ejecución de un estudio metabolómico exhaustivo. Póngase en contacto con nosotros hoy mismo para empezar.