Chapitre 9 - Conception d'une étude métabolomique

Quel est votre objectif d'étude ?

La partie la plus importante de toute étude métabolomique est la définition du champ d'application de l'étude. Deux approches peuvent être utilisées : globale ou ciblée. Les approches métabolomiques globales, ou non ciblées, sont semi-quantitatives et prennent en compte toutes les données métaboliques de sortie, tandis que les études ciblées utilisent des panels de métabolites connus pour quantifier les quantités de ces métabolites spécifiques dans le(s) échantillon(s) considéré(s). Le choix de l'approche, ou d'une combinaison des deux, dépend de votre question de recherche.

Pour ceux qui souhaitent identifier de nouveaux biomarqueurs ou comprendre la présence d'un large éventail de métabolites, la métabolomique globale est le meilleur choix. En revanche, si vous savez ce que vous cherchez et que vous souhaitez connaître la quantité d'un métabolite ou d'un groupe de métabolites spécifiques présents dans votre échantillon, vous aurez besoin d'une approche ciblée. Chez Metabolon, nous fournissons des panels ciblés pour les acides aminés, les acides biliaires, les carbones centraux, les lipides complexes, les acides gras, l'intolérance au glucose, la résistance à l'insuline, les acides gras à chaîne courte, etc. Et, bien sûr, nous pouvons vous aider à développer des panels ciblés sur mesure, spécifiques à vos objectifs de recherche.

En raison de leur nature, les panels ciblés ont nécessairement une couverture analytique limitée par rapport aux panels globaux, mais ils sont plus sensibles et reproductibles que les approches non ciblées. Il peut également être difficile d'identifier des composés inconnus à l'aide de panels globaux, principalement en raison de la disponibilité limitée des normes analytiques et des informations spectrales dans les bases de données publiques^.1 Souvent, les chercheurs optent pour une approche à deux volets afin d'obtenir le meilleur des deux mondes : commencer par une approche globale et utiliser ensuite la métabolomique ciblée pour mieux comprendre les analytes clés d'intérêt.

Quelle que soit l'approche ou la combinaison d'approches choisie, il est important de définir ce paramètre de l'étude dès le départ, car cela permettra de déterminer les types et les quantités d'échantillons nécessaires pour rendre la collecte de données aussi simple que possible.

Quelle est la meilleure technologie pour votre étude ?

Comme indiqué brièvement dans les chapitres précédents de ce guide, deux technologies principales sont utilisées pour obtenir des données sur les métabolites : la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS).

• RMN : la RMN expose les échantillons à un champ magnétique et à une impulsion de radiofréquence afin d'identifier les composés sur la base de l'énergie de résonance du rayonnement électromagnétique absorbé et réémis par les noyaux cellulaires. Dans le cadre de la métabolomique, les atomes de proton des petites molécules sont généralement analysés (RMN-1H). Il s'agit d'une méthode hautement reproductible capable de mesurer des dizaines à une centaine de métabolites à partir de divers types d'échantillons.
• LC-MS : Les spectromètres de masse mesurent les petites molécules en les ionisant (en leur ajoutant une charge) et en les détectant lorsqu'elles se déplacent dans le spectromètre. En utilisant la chromatographie liquide (CL) pour séparer physiquement les molécules présentes dans un échantillon avant l'ionisation dans le spectromètre de masse, les chercheurs peuvent travailler avec des échantillons de très petite taille (jusqu'à 0,1 μL) pris en charge par la CL pour détecter des milliers de métabolites à partir de divers types d'échantillons^.2-5

Chaque méthode a ses avantages et ses inconvénients. Le principal avantage de la RMN est qu'elle est non invasive et qu'elle ne détruit pas l'^{échantillon6,} ce qui signifie que vous pouvez réutiliser vos échantillons pour d'autres recherches expérimentales (y compris la LC-MS complémentaire, si vous le souhaitez).

Les échantillons ne sont pas détruits pendant la RMN car la technologie ne nécessite pas de prétraitement ou de séparation des échantillons avant l'identification, contrairement à la LC-MS, ce qui rend la préparation des échantillons pour la RMN beaucoup plus simple^.6 En outre, la RMN est hautement reproductible et quantitative, car l'intensité des pics électromagnétiques est directement proportionnelle au nombre de noyaux dans l'échantillon.^{6 C'est également une méthode puissante pour identifier des métabolites inconnus,6 ce qui en fait un excellent outil pour la découverte de nouveaux biomarqueurs.7}

Contrairement à la RMN, la LC-MS peut mesurer des milliers de métabolites à la fois et est souvent utilisée pour analyser différentes classes de métabolites à partir du même échantillon, ce qui permet d'obtenir une couverture plus large du métabolome que la^RMN6. Les techniques de SM actuellement disponibles sont incroyablement sensibles et précises et offrent une résolution de masse élevée, ce qui signifie que plus de 80 % des voies présentes dans la base de données KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) peuvent être détectées à l'aide de cette méthode^.1

Le faire soi-même ou l'externaliser ?

La prochaine chose à déterminer avant même de commencer à collecter des échantillons est de savoir si vous allez exécuter votre projet en interne ou l'externaliser. Poser cette question dès le départ peut vous faire gagner beaucoup de temps et d'argent, et vous aidera à cibler vos objectifs de recherche de manière appropriée en tenant compte des limites, des risques et des coûts associés à chaque option.

En interne

• Avantages: aucun risque de perte ou de détérioration des échantillons pendant le transport, possibilité de commencer à traiter les échantillons immédiatement, vous savez exactement quand vos données reviendront.
• Inconvénients: nécessité d'acheter ou de louer des instruments et d'avoir accès à des logiciels d'analyse, nécessité de disposer de ses propres normes de recherche et de ses propres bibliothèques de référence, nécessité d'un savoir-faire pour interpréter les données en toute confiance.

Bien que certains kits puissent être achetés pour faciliter les projets métabolomiques internes, ils sont généralement semi-quantitatifs et ne permettent donc pas de réaliser des études ciblées. Ils peuvent également ne pas avoir la meilleure couverture, ce qui signifie que vous risquez de manquer des découvertes scientifiques importantes. Si vous n'avez pas l'intention d'effectuer régulièrement des analyses métabolomiques, l'investissement financier dans les instruments, les logiciels et le personnel formé à la manipulation des échantillons, à l'utilisation des instruments et à l'analyse des données n'en vaut peut-être pas la peine.

Externalisé

• Avantages: accès à des experts en métabolomique qui exploitent et interprètent quotidiennement les données métabolomiques, accès à la meilleure technologie disponible pour une précision et une confiance maximales, méthodes entièrement validées pour la reproductibilité et la fiabilité dans les cohortes.
• Inconvénients: peut ne pas être réalisable pour des analyses urgentes en raison des délais d'expédition et de traitement des données ; le paiement à l'acte peut ne pas être adapté à tous les projets ou à tous les budgets.

L'externalisation de vos études métabolomiques peut être angoissante, surtout si vous travaillez avec des échantillons limités et difficiles à obtenir. C'est pourquoi il est essentiel que vous choisissiez un partenaire métabolomique digne de confiance, avec une expertise sur laquelle vous pouvez compter. Metabolon propose plusieurs modèles de collaboration pour répondre à vos besoins de recherche, depuis le traitement des échantillons et des données jusqu'à l'analyse et l'interprétation complètes. Nos 20 ans d'expérience dans l'optimisation des protocoles et le travail avec des centaines de types d'échantillons, combinés à notre bibliothèque de référence contenant plus de 5 400 métabolites, signifient que nous sommes parfaitement équipés pour vous aider à concevoir votre étude, à collecter les bons échantillons de la bonne manière, et à obtenir des données de la plus haute qualité possible avec des réponses significatives et définitives à vos questions de recherche.

Prélèvement, préparation, stockage et expédition des échantillons

Comme nous l'avons brièvement évoqué au chapitre 4 de ce guide, plusieurs types d'échantillons peuvent être analysés à l'aide de protocoles métabolomiques, notamment des cellules en culture, des tissus, des selles, du sang, de l'urine et de la sueur. La source d'échantillon utilisée dépend de votre objectif de recherche ; par exemple, vous choisirez des selles si vous voulez étudier l'impact du microbiome intestinal sur l'acquisition des nutriments par l'hôte, mais vous travaillerez avec des échantillons de tissus si vous voulez identifier les biomarqueurs qui différencient les tumeurs primaires et les métastases. En planifiant à l'avance, vous pourrez établir votre budget dès le départ et éviter de devoir ajouter des échantillons plus tard ou de demander des prolongations de financement.

Chaque type d'échantillon nécessite une manipulation et une préparation différentes, qui sont également influencées par le choix d'une approche ciblée ou non ciblée et par l'utilisation de la RMN ou de la LC-MS. Si vous réalisez votre projet en interne, vous devrez vous assurer que vous savez comment manipuler vos échantillons de manière appropriée. Pour les échantillons particulièrement difficiles, l'externalisation est souvent l'option la plus facile et la plus économique, en particulier si vous travaillez avec un nombre limité d'échantillons. Pour chaque projet, Metabolon offre gratuitement un kit de manipulation des échantillons Study Success, personnalisé spécifiquement pour votre étude. Ce kit comprend des tubes à code-barres spécifiques à votre matrice (c'est-à-dire des biofluides, des échantillons solides ou des culots cellulaires) et des instructions pour l'envoi de vos échantillons afin qu'ils nous parviennent en toute sécurité. Si vous stockez de grandes quantités d'échantillons dans un dépôt biologique ou une biobanque, nous travaillerons même directement avec le personnel de ces établissements pour préparer et expédier vos échantillons.

Interprétation des données

L'interprétation des données est souvent la partie la plus difficile de tout projet de métabolomique. Les instruments ne produisent pas de résumés faciles à lire avec de beaux graphiques ; au lieu de cela, vous obtenez des tableaux avec une infinité de colonnes et de valeurs que vous devez transformer en informations compréhensibles à l'aide de l'un des nombreux outils logiciels disponibles (certains sont gratuits, d'autres payants). Si aucun membre de votre équipe n'est formé à l'analyse des données de RMN ou de LC-MS, vous risquez de manquer de confiance dans votre interprétation et de passer à côté d'observations importantes et exploitables. L'externalisation de l'analyse et de l'interprétation des données peut vous faire gagner beaucoup de temps et d'argent et vous éviter de devoir refaire des expériences.

En travaillant avec Metabolon, vous ne serez jamais laissé dans l'ignorance lors de l'interprétation de vos données. Les panels globaux bénéficient d'un accès continu au portailMyMetabolon , où vous pouvez accéder à l'interprétation personnalisée de nos directeurs d'étude titulaires d'un doctorat, aux tests statistiques qu'ils ont effectués et à des visualisations de données entièrement personnalisables. Bien que les panels ciblés ne bénéficient pas des mêmes analyses et visualisations statistiques que les panels globaux, nous fournissons un tableau de données formaté prêt à être importé et analysé avec des outils tiers tels que R et Python.

Pour les groupes de recherche qui souhaitent externaliser l'identification et la quantification des métabolites, mais pas l'interprétation des données, nous proposons également des données seules. Cette option peut être intéressante pour les laboratoires qui disposent de l'expertise nécessaire pour l'analyse des données, mais qui n'ont pas nécessairement accès à l'instrumentation appropriée ou qui n'ont pas les moyens de l'acheter, ou qui travaillent avec des types d'échantillons qui ne relèvent pas de leur expertise.

Quelle est la prochaine étape ?

Après avoir parcouru ce guide, vous êtes prêt à commencer à réaliser vos propres études métabolomiques et à expérimenter la puissance scientifique qu'elles ont à offrir. Nous sommes là pour vous aider dans votre démarche, que vous ayez simplement besoin que nous traitions vos échantillons ou que nous travaillions avec vous individuellement du début à la fin pour concevoir et réaliser une étude métabolomique pertinente. Contactez-nous dès aujourd'hui pour commencer !

Références

1. Bedia C. Metabolomics in environmental toxicology : Applications et défis. Trends in Env Anal Chem. 2022;34:e00161. doi : 10.1016/j.teac.2022.e00161
2. Silva Siqueira Sandrin V, Moraes Oliveira G, Weckwerth GM et al. Analysis of Different Methods of Extracting NSAIDs in Biological Fluid Samples for LC-MS/MS Assays : Scoping Review. Metabolites. 2022;12(8):751. doi : 10.3390/metabo12080751
3. Thevia M, Krug O, Geyer H et al. Expanding analytical options in sports drug testing : Mass spectrometric detection of prohibited substances in exhaled breath. Rapid Commun Mass Spectrom. 2017;31(15):1290-1296. doi : 10.1002/rcm.7903
4. Frank N, Bessaire T, Tarres A et al. Development of a quantitative multi-compound method for the detection of 14 nitrogen-rich adulterants by LC-MS/MS in food materials. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess. 2017;34(11):1842-1852. doi : 10.1080/19440049.2017.1372640
5. Zwiener C et Frimmel FH. LC-MS Analysis in the aquatic environment and in water treatment - a critical review. Partie I : Instrumentation et aspects généraux de l'analyse et de la détection. Anal Bioanal Chem. 2004;378(4):851-861. doi : 10.1007/s00216-003-2404-1
6. Nagana Gowda GA et Raftery D. NMR Based Metabolomics. Adv Exp Med Biol. 2021;1280:19-37. doi : 10.1007/978-3-030-51652-9_2
7. Emwas AH, Roy R, McKay RT et al. Recommendations and Standardization of Biomarker Quantification Using NMR-Based Metabolomics with Particular Focus on Urinary Analysis. J Proteome Res. 2016;15(2):360-373. doi : 10.1021/acs.jproteome.5b00885