Cuantificación
La espectrometría de masas es una tecnología inherentemente semicuantitativa y altamente sensible que mide las diferencias relativas de cantidad de un metabolito individual, expresadas por las variaciones de intensidad del pico del metabolito en muestras comparativas. La cuantificación puede ser relativa (analizada en relación con una muestra de referencia) o absoluta (analizada utilizando un método de curva estándar).
Enfoques metabolómicos de la normalización
La normalización de las muestras en metabolómica es fundamental para obtener información biológica precisa, pero hay que tener cuidado debido a la diversidad de estructuras y comportamientos de los metabolitos. Existen diferentes enfoques de normalización, incluidos los métodos que ajustan:
- Basándose en la intensidad de la señal de la muestra, por ejemplo, dividiendo el valor de intensidad de cada característica o pico detectado en la muestra por la intensidad total de toda la muestra (normalización del recuento total de iones (TIC));
- Basándose en la intensidad de la señal individual de cada metabolito. Los ejemplos incluyen 1) dividir el valor de intensidad de cada metabolito por su intensidad mediana en las muestras experimentales o 2) dividir el valor de intensidad de cada metabolito por su intensidad mediana en las muestras de control. Las muestras de control representan una matriz de QC que idealmente se agrupa a partir de muestras representativas de la población del estudio (si esta opción no está disponible debido a limitaciones de la muestra o viabilidad, Metabolon mantiene matrices de QC agrupadas para varios tipos de muestras diferentes).
Metabolómica global no dirigida-Cuantificación relativa
En la metabolómica no dirigida, no existe un método estándar para medir la cantidad total de metabolitos directamente, sin embargo, Metabolon ha realizado amplios análisis respaldados por publicaciones y ha descubierto que el segundo enfoque mencionado supera ampliamente a otros métodos.1
"Al realizar la normalización de los datos metabolómicos, es importante que el método corrija adecuadamente la variación sistemática pero preserve la variación biológica", afirma Greg Michelotti, Director Senior de Estrategia Científica y Traslacional de Metabolon.
En un estudio de 2018, determinamos la mejor manera de normalizar los datos de metabolómica basándonos en el análisis de muestras de plasma obtenidas de participantes en el Estudio de resistencia a la insulina y aterosclerosis (IRAS, por sus siglas en inglés).1 De esta cohorte, se analizaron 1716 muestras utilizando el Metabolon Global Discovery Panel. Acomodar tantas muestras requirió entre 13 y 15 ejecuciones del instrumento por brazo de la plataforma. El análisis resultante midió 1.274 metabolitos. El perfil metabolómico no dirigido se comparó con un panel dirigido independiente para un subconjunto de metabolitos representativos de múltiples clases bioquímicas. En este estudio, demostramos que los métodos de normalización que se basan en ajustes específicos de metabolitos superaron significativamente a los métodos que realizan ajustes en cada muestra, como la normalización del recuento total de iones (TIC).
Normalización metabolómica para la cuantificación relativa
En muchos casos, las normalizaciones basadas en muestras funcionaron peor que no realizar ninguna normalización. La corrección por el valor mediano del lote de las muestras experimentales (MED) puede funcionar bien en varias aplicaciones: para cada metabolito, divida las áreas de pico brutas de una muestra por la mediana de las áreas de pico brutas de todas las muestras del mismo lote del instrumento.
Sin embargo, supongamos que se quiere analizar un conjunto muy pequeño y fusionarlo con conjuntos de datos anteriores o comparar los valores de dos conjuntos de datos diferentes. En ese caso, suele ser mejor normalizar mediante muestras de control puente (BRDG): para cada metabolito, dividir las áreas de pico brutas de una muestra dada por la mediana de las áreas de pico brutas de las muestras de control puente. El principal inconveniente del BRDG es que los metabolitos que no están presentes en las muestras puente no pueden normalizarse.1
Metabolómica dirigida-Cuantificación absoluta
Referencias
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Una vez que se ha visto todo el valor de la metabolómica, la única pregunta que queda es: ¿quién lo hace mejor? Aunque muchos laboratorios cuentan con capacidades de perfilado de metabolitos o de química analítica, las tecnologías metabolómicas completas son extremadamente escasas. La identificación precisa e imparcial de metabolitos en todo el metaboloma plantea problemas de relación señal-ruido que muy pocos laboratorios están preparados para afrontar. Además, traducir cantidades masivas de datos en información procesable es lento, si no imposible, para la mayoría, porque una interpretación adecuada requiere dos cosas que escasean: experiencia y una base de datos completa.
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