Preparación, almacenamiento y transporte de muestras de metabolómica

Directrices para la recogida y almacenamiento de muestras metabolómicas

Sample collection is the first execution step in any metabolomics study. The importance of a robust sampling procedure cannot be understated. Improper collection protocols or the use of inappropriate collection devices can adversely impact instrumentation outputs and the resulting metabolomes.² Researchers also study many kinds of clinical and environmental specimens, each of which contains diverse chemical components and matrices. Thus, the type of sample being studied plays the biggest role in determining appropriate collection and processing procedures. Here are some important considerations as you prepare your collection procedures:

• Some sample types can change form. Blood samples are prone to coagulation, a process that prevents excess blood loss by changing it into a solid or semi-solid state. While serum samples are obtained after coagulation, plasma collection requires an anticoagulant such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) to be added.³ Doing so retains plasma in its liquid form for processing.
• There can be a delay before freezing samples. A delay between sample collection and processing is common, which can impact metabolomes. In some cases, sample collection methods allow for room temperature storage. Utilizing the validated OMNIMet™•GUT tubes is one way to enable room temperature storage of human fecal samples prior to processing which preserves the metabolomic profile.⁴ For most other sample types, freezing is more appropriate for storage and should be done as soon as possible after collection.⁵
• Ensure that freeze-thaw cycles are minimized. While freezing samples is the gold standard for preserving metabolomes, freeze-thaw cycles are incredibly damaging to the metabolome.⁶ If possible, samples should be homogenized and aliquoted to avoid damage due to freeze-thaw cycles and reduce intra-sample variation.
• Algunas muestras pueden requerir liofilización. La liofilización comienza con un paso de congelación seguido de un paso de vacío para eliminar el agua de las muestras. El resultado es que el hielo se convierte en vapor sin pasar por la fase líquida. La liofilización se emplea habitualmente en células vegetales para minimizar los cambios de oxidación dentro de las células^.7

Todos los estudios realizados con Metabolon reciben nuestro kit de manipulación de muestras Study Success, personalizado específicamente para su estudio. En el kit se incluyen tubos con códigos de barras específicos para su matriz (es decir, biofluidos, muestras sólidas o gránulos celulares), un escáner de códigos de barras e instrucciones para enviarnos sus muestras por correo para garantizar que lleguen de forma segura.

The Importance of Robust Sample Preparation
Reproducibility remains a critical issue in all areas of research including metabolomics. For instance, inter-lab variation in metabolite profiles can stem from differences in the mass spectrometry equipment or normalization method used.⁸ Metabolomes are typically analyzed from clinical or environmental specimens as a proxy of the environment being studied. Handling these samples properly reduces the likelihood that technical error produces variation among the metabolomes. Listed below are some factors to consider to minimize variation caused by sample handling:

• Sample degradation. Several variables inherent to the sample can affect its chemical composition during sample processing. Clinical and biological samples contain enzymes that can degrade metabolites and change their native metabolomes prior to processing the sample(s).^9,10 Ensure that samples are appropriately stored and quickly processed to minimize these effects.
• Bias in metabolomics data. Any sample processing method can affect the metabolites present at the point of sample extraction. Wash steps and chemical processing can wash away or introduce reagent-derived chemicals that alter metabolomic outputs. Even minute variations in sample handling can generate biased results and false positives in serum metabolomes.¹¹ Any robust metabolomics study must document these procedures carefully and define how each sample was processed.
• Instrument interference. Samples can contain compounds that interfere with a mass spectrometer’s ability to detect metabolites.¹² Ion suppression, the most notable of these interferences, occurs when ionized analytes such as salts, drugs, and other endogenous metabolites compete for charge.¹³ This affects the sets of metabolites detected by a mass spectrometer and can skew metabolome profiles. Sample processing procedures must note the presence of these compounds and plan accordingly.

En conjunto, disponer de un procedimiento operativo estandarizado para procesar muestras para el perfilado del metaboloma le ayudará a generar resultados metabolómicos fiables y permitirá realizar comparaciones científicamente sólidas.

Consideraciones sobre el envío de muestras metabolómicas

En muchos casos, las muestras deben transportarse al laboratorio donde se procesarán desde un lugar externo. Se han desarrollado protocolos para el transporte de muestras con el fin de minimizar su impacto en los análisis posteriores. Para perfeccionar este proceso, los científicos han identificado varios factores importantes que deben tenerse en cuenta a la hora de preparar las muestras para su envío:

• Documentación detallada: Cada muestra individual tiene características únicas, incluso entre grupos de muestras recogidas de la misma fuente. Distinguir entre las muestras y sus orígenes puede ayudar a los investigadores a correlacionar las características de las muestras con el fenotipo de un paciente o a delinear los procesos ambientales que tienen lugar en un lugar determinado. Para facilitar este proceso, todas las muestras deben contar con manifiestos digitales detallados que permitan rastrear sus características y orígenes. Un sistema sólido de codificación de proyectos que no invada la intimidad de las personas facilitará mucho este proceso.
• Almacenamiento duradero de las muestras: El entorno exterior debe influir lo menos posible en la composición de la muestra durante el transporte. Conscientes de ello, los científicos han desarrollado múltiples métodos para conservar las características de las muestras durante el transporte. Uno de ellos, la congelación inmediata en nitrógeno líquido, reduce el riesgo de actividad metabólica de las enzimas endógenas. Alicuotar las muestras antes de congelarlas también ayuda a minimizar los ciclos de congelación y descongelación tras su almacenamiento. El uso de tubos de recogida de muestras duraderos también garantizará la viabilidad de las muestras.

En Metabolon, trabajamos con usted para desarrollar un protocolo de envío que garantice que sus muestras nos llegan de forma segura. Si almacena grandes cantidades de muestras en un biorrepositorio o biobanco, incluso trabajaremos directamente con el personal de allí para preparar y enviar sus muestras.

Puede obtener más información sobre nuestros procesos de manipulación de muestras o solicitar un kit de muestras de demostración visitando nuestra página Recursos para el envío de muestras.

¿Y ahora qué?

En este capítulo hemos dado una visión de conjunto de los factores clave que hay que tener en cuenta a la hora de desarrollar un procedimiento de muestreo. Hemos mostrado la importancia de manipular las muestras con cuidado, recogerlas rápidamente y conservar sus características químicas durante el transporte. Aunque cada tipo de muestra tiene características únicas que requieren procedimientos de recogida de muestras distintos, cada una tiene consideraciones similares para garantizar la reproducibilidad de los datos metabolómicos. En el próximo capítulo, nos adentraremos en el análisis y la interpretación de los datos metabolómicos para extraer información biológica útil.

Referencias

1. Smith L, Villaret-Cazadamont J, Claus SP, et al. Important Considerations for Sample Collection in Metabolomics Studies with a Special Focus on Applications to Liver Functions. Metabolites. 2020;10(3):104. doi:10.3390/metabo10030104
2. Bowen RAR, Remaley AT. Interferences from blood collection tube components on clinical chemistry assays. Biochem Med (Zagreb). 2014;24(1):31-44. doi:10.11613/BM.2014.006
3. Kiseleva O, Kurbatov I, Ilgisonis E, Poverennaya E. Defining Blood Plasma and Serum Metabolome by GC-MS. Metabolites. 2021;12(1):15. doi:10.3390/metabo12010015
4. Lim MY, Hong S, Kim BM, Ahn Y, Kim HJ, Nam YD. Changes in microbiome and metabolomic profiles of fecal samples stored with stabilizing solution at room temperature: a pilot study. Sci Rep. 2020;10(1):1789. doi:10.1038/s41598-020-58719-8
5. Haukaas TH, Moestue SA, Vettukattil R, et al. Impact of Freezing Delay Time on Tissue Samples for Metabolomic Studies. Front Oncol. 2016;6:17. doi:10.3389/fonc.2016.00017
6. Chen D, Han W, Huan T, Li L, Li L. Effects of Freeze-Thaw Cycles of Blood Samples on High-Coverage Quantitative Metabolomics. Anal Chem. 2020;92(13):9265-9272. doi:10.1021/acs.analchem.0c01610
7. Papageorgiou V, Mallouchos A, Komaitis M. Investigation of the Antioxidant Behavior of Air- and Freeze-Dried Aromatic Plant Materials in Relation to Their Phenolic Content and Vegetative Cycle. J Agric Food Chem. 2008;56(14):5743-5752. doi:10.1021/jf8009393
8. Lin Y, Caldwell GW, Li Y, Lang W, Masucci J. Inter-laboratory reproducibility of an untargeted metabolomics GC-MS assay for analysis of human plasma. Sci Rep. 2020;10(1):10918. doi:10.1038/s41598-020-67939-x
9. Villas-Boas SG, Nielsen J, Smedsgaard J, Hansen MA, Roessner-Tunali U. Metabolome Analysis: An Introduction. John Wiley & Sons; 2007.
10. Lu W, Su X, Klein MS, Lewis IA, Fiehn O, Rabinowitz JD. Metabolite Measurement: Pitfalls to Avoid and Practices to Follow. Annu Rev Biochem. 2017;86:277-304. doi:10.1146/annurev-biochem-061516-044952
11. McClain KM, Moore SC, Sampson JN, et al. Preanalytical Sample Handling Conditions and Their Effects on the Human Serum Metabolome in Epidemiologic Studies. Am J Epidemiol. 2020;190(3):459-467. doi:10.1093/aje/kwaa202
12. Roberts LD, Souza AL, Gerszten RE, Clish CB. Metabolómica dirigida. Curr Protoc Mol Biol. 2012;CAPÍTULO:Unidad30.2. doi:10.1002/0471142727.mb3002s98
13. Annesley TM. Supresión iónica en espectrometría de masas. Clin Chem. 2003;49(7):1041-1044. doi:10.1373/49.7.1041