Capítulo 5 - Preparación, almacenamiento y transporte de muestras de metabolómica

Directrices para la recogida y almacenamiento de muestras metabolómicas

La recogida de muestras es el primer paso de ejecución en cualquier estudio metabolómico. No se puede subestimar la importancia de un procedimiento de recogida de muestras sólido.^Los protocolos de recogida inadecuados o el uso de dispositivos de recogida inapropiados pueden afectar negativamente a los resultados de la instrumentación y a los metabolomas resultantes^.2 Los investigadores también estudian muchos tipos de muestras clínicas y ambientales, cada una de las cuales contiene diversos componentes químicos y matrices. Por lo tanto, el tipo de muestra que se estudia desempeña el papel más importante a la hora de determinar los procedimientos de recogida y procesamiento adecuados. A continuación se exponen algunas consideraciones importantes a la hora de preparar los procedimientos de recogida:

• Algunos tipos de muestras pueden cambiar de forma. Las muestras de sangre son propensas a la coagulación, un proceso que evita la pérdida excesiva de sangre cambiándola a un estado sólido o semisólido. Mientras que las muestras de suero se obtienen tras la coagulación, la obtención de plasma requiere la adición de un anticoagulante como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)^.3 Al hacerlo, el plasma se conserva en su forma líquida para su procesamiento.
• Puede haber un retraso antes de congelar las muestras. Es habitual que se produzca un retraso entre la recogida y el procesamiento de las muestras, lo que puede afectar a los metabolomas. En algunos casos, los métodos de recogida de muestras permiten el almacenamiento a temperatura ambiente. La utilización de los tubos OMNIMet™-GUT validados es una forma de permitir el almacenamiento a temperatura ambiente de muestras fecales humanas antes del procesamiento, lo que preserva el perfil metabolómico^.4 Para la mayoría de los demás tipos de muestras, la congelación es más adecuada para el almacenamiento y debe realizarse lo antes posible tras la recogida^.5
• Asegúrese de minimizar los ciclos de congelación y descongelación. Aunque la congelación de las muestras es la regla de oro para la conservación de los metabolomas, los ciclos de congelación-descongelación son increíblemente perjudiciales para el metaboloma^.6 Si es posible, las muestras deben homogeneizarse y alicuotarse para evitar daños debidos a los ciclos de congelación-descongelación y reducir la variación intra-muestra.
• Algunas muestras pueden requerir liofilización. La liofilización comienza con un paso de congelación seguido de un paso de vacío para eliminar el agua de las muestras. El resultado es que el hielo se convierte en vapor sin pasar por la fase líquida. La liofilización se emplea habitualmente en células vegetales para minimizar los cambios de oxidación dentro de las células^.7

Todos los estudios realizados con Metabolon reciben nuestro kit de manipulación de muestras Study Success, personalizado específicamente para su estudio. En el kit se incluyen tubos con códigos de barras específicos para su matriz (es decir, biofluidos, muestras sólidas o gránulos celulares), un escáner de códigos de barras e instrucciones para enviarnos sus muestras por correo para garantizar que lleguen de forma segura.

La importancia de una preparación sólida de las muestras
La reproducibilidad sigue siendo una cuestión crítica en todas las áreas de investigación, incluida la metabolómica. Por ejemplo, la variación entre laboratorios en los perfiles de metabolitos puede deberse a diferencias en el equipo de espectrometría de masas o en el método de normalización utilizado^.8 Los metabolomas suelen analizarse a partir de muestras clínicas o ambientales como representación del entorno estudiado. La manipulación adecuada de estas muestras reduce la probabilidad de que un error técnico produzca variaciones entre los metabolomas. A continuación se enumeran algunos factores a tener en cuenta para minimizar la variación causada por la manipulación de las muestras:

• Degradación de la muestra. Diversas variables inherentes a la muestra pueden afectar a su composición química durante el procesamiento de la misma. Las muestras clínicas y biológicas contienen enzimas que pueden degradar metabolitos y cambiar sus metabolomas nativos antes del procesamiento de la(s) muestra(s)^.9,10 Asegúrese de que las muestras se almacenan adecuadamente y se procesan con rapidez para minimizar estos efectos.
• Sesgo en los datos metabolómicos. Cualquier método de procesamiento de muestras puede afectar a los metabolitos presentes en el punto de extracción de la muestra. Los pasos de lavado y el procesamiento químico pueden eliminar o introducir sustancias químicas derivadas de reactivos que alteran los resultados metabolómicos. Incluso variaciones mínimas en la manipulación de la muestra pueden generar resultados sesgados y falsos positivos en los metabolomas del suero^.11 Cualquier estudio metabolómico sólido debe documentar estos procedimientos cuidadosamente y definir cómo se procesó cada muestra.
• Interferencias del instrumento. Las muestras pueden contener compuestos que interfieran con la capacidad de un espectrómetro de masas para detectar metabolitos^.12 La supresión iónica, la más notable de estas interferencias, se produce cuando analitos ionizados como sales, fármacos y otros metabolitos endógenos compiten por la carga^.13 Esto afecta a los conjuntos de metabolitos detectados por un espectrómetro de masas y puede sesgar los perfiles del metaboloma. Los procedimientos de procesamiento de muestras deben tener en cuenta la presencia de estos compuestos y planificarse en consecuencia.

En conjunto, disponer de un procedimiento operativo estandarizado para procesar muestras para el perfilado del metaboloma le ayudará a generar resultados metabolómicos fiables y permitirá realizar comparaciones científicamente sólidas.

Consideraciones sobre el envío de muestras metabolómicas

En muchos casos, las muestras deben transportarse al laboratorio donde se procesarán desde un lugar externo. Se han desarrollado protocolos para el transporte de muestras con el fin de minimizar su impacto en los análisis posteriores. Para perfeccionar este proceso, los científicos han identificado varios factores importantes que deben tenerse en cuenta a la hora de preparar las muestras para su envío:

• Documentación detallada: Cada muestra individual tiene características únicas, incluso entre grupos de muestras recogidas de la misma fuente. Distinguir entre las muestras y sus orígenes puede ayudar a los investigadores a correlacionar las características de las muestras con el fenotipo de un paciente o a delinear los procesos ambientales que tienen lugar en un lugar determinado. Para facilitar este proceso, todas las muestras deben contar con manifiestos digitales detallados que permitan rastrear sus características y orígenes. Un sistema sólido de codificación de proyectos que no invada la intimidad de las personas facilitará mucho este proceso.
• Almacenamiento duradero de las muestras: El entorno exterior debe influir lo menos posible en la composición de la muestra durante el transporte. Conscientes de ello, los científicos han desarrollado múltiples métodos para conservar las características de las muestras durante el transporte. Uno de ellos, la congelación inmediata en nitrógeno líquido, reduce el riesgo de actividad metabólica de las enzimas endógenas. Alicuotar las muestras antes de congelarlas también ayuda a minimizar los ciclos de congelación y descongelación tras su almacenamiento. El uso de tubos de recogida de muestras duraderos también garantizará la viabilidad de las muestras.

En Metabolon, trabajamos con usted para desarrollar un protocolo de envío que garantice que sus muestras nos llegan de forma segura. Si almacena grandes cantidades de muestras en un biorrepositorio o biobanco, incluso trabajaremos directamente con el personal de allí para preparar y enviar sus muestras.

Puede obtener más información sobre nuestros procesos de manipulación de muestras o solicitar un kit de muestras de demostración visitando nuestra página Recursos para el envío de muestras.

¿Y ahora qué?

En este capítulo hemos dado una visión de conjunto de los factores clave que hay que tener en cuenta a la hora de desarrollar un procedimiento de muestreo. Hemos mostrado la importancia de manipular las muestras con cuidado, recogerlas rápidamente y conservar sus características químicas durante el transporte. Aunque cada tipo de muestra tiene características únicas que requieren procedimientos de recogida de muestras distintos, cada una tiene consideraciones similares para garantizar la reproducibilidad de los datos metabolómicos. En el próximo capítulo, nos adentraremos en el análisis y la interpretación de los datos metabolómicos para extraer información biológica útil.

Referencias

1. Smith L, Villaret-Cazadamont J, Claus SP, et al. Important Considerations for Sample Collection in Metabolomics Studies with a Special Focus on Applications to Liver Functions. Metabolites. 2020;10(3):104. doi:10.3390/metabo10030104
2. Bowen RAR, Remaley AT. Interferences from blood collection tube components on clinical chemistry assays. Biochem Med (Zagreb). 2014;24(1):31-44. doi:10.11613/BM.2014.006
3. Kiseleva O, Kurbatov I, Ilgisonis E, Poverennaya E. Defining Blood Plasma and Serum Metabolome by GC-MS. Metabolites. 2021;12(1):15. doi:10.3390/metabo12010015
4. Lim MY, Hong S, Kim BM, Ahn Y, Kim HJ, Nam YD. Changes in microbiome and metabolomic profiles of fecal samples stored with stabilizing solution at room temperature: a pilot study. Sci Rep. 2020;10(1):1789. doi:10.1038/s41598-020-58719-8
5. Haukaas TH, Moestue SA, Vettukattil R, et al. Impact of Freezing Delay Time on Tissue Samples for Metabolomic Studies. Front Oncol. 2016;6:17. doi:10.3389/fonc.2016.00017
6. Chen D, Han W, Huan T, Li L, Li L. Effects of Freeze-Thaw Cycles of Blood Samples on High-Coverage Quantitative Metabolomics. Anal Chem. 2020;92(13):9265-9272. doi:10.1021/acs.analchem.0c01610
7. Papageorgiou V, Mallouchos A, Komaitis M. Investigation of the Antioxidant Behavior of Air- and Freeze-Dried Aromatic Plant Materials in Relation to Their Phenolic Content and Vegetative Cycle. J Agric Food Chem. 2008;56(14):5743-5752. doi:10.1021/jf8009393
8. Lin Y, Caldwell GW, Li Y, Lang W, Masucci J. Inter-laboratory reproducibility of an untargeted metabolomics GC-MS assay for analysis of human plasma. Sci Rep. 2020;10(1):10918. doi:10.1038/s41598-020-67939-x
9. Villas-Boas SG, Nielsen J, Smedsgaard J, Hansen MA, Roessner-Tunali U. Metabolome Analysis: An Introduction. John Wiley & Sons; 2007.
10. Lu W, Su X, Klein MS, Lewis IA, Fiehn O, Rabinowitz JD. Metabolite Measurement: Pitfalls to Avoid and Practices to Follow. Annu Rev Biochem. 2017;86:277-304. doi:10.1146/annurev-biochem-061516-044952
11. McClain KM, Moore SC, Sampson JN, et al. Preanalytical Sample Handling Conditions and Their Effects on the Human Serum Metabolome in Epidemiologic Studies. Am J Epidemiol. 2020;190(3):459-467. doi:10.1093/aje/kwaa202
12. Roberts LD, Souza AL, Gerszten RE, Clish CB. Metabolómica dirigida. Curr Protoc Mol Biol. 2012;CAPÍTULO:Unidad30.2. doi:10.1002/0471142727.mb3002s98
13. Annesley TM. Supresión iónica en espectrometría de masas. Clin Chem. 2003;49(7):1041-1044. doi:10.1373/49.7.1041