Capítulo 4 - Tipos de muestras para metabolómica

Metabolitos en sangre

La sangre humana contiene cientos de metabolitos que actúan como útiles herramientas de diagnóstico de la salud de una persona. Recoger muestras de sangre puede parecer un proceso trivial, pero hay que tener en cuenta varias consideraciones importantes a la hora de tomar y procesar muestras de sangre:

• Las muestras de sangre pueden procesarse como plasma o suero. El plasma y el suero se obtienen de la porción líquida de la sangre una vez extraídas las células. El suero es la porción líquida después de que se haya producido la coagulación, mientras que el plasma es la porción líquida que queda después de añadir un anticoagulante. Ambos tipos de muestras producen metabolomas similares^,1 pero ciertos anticoagulantes como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o el citrato^,2 pueden aparecer en los metabolomas del plasma. Es menos probable que la heparina interfiera con las señales de espectrometría de masas (EM). Considere cuidadosamente qué anticoagulante va a utilizar si está estudiando plasma y asegúrese de que dispone de un plan para eliminar la señal de fondo durante el análisis de datos, si fuera necesario.
• Evite la hemólisis a toda costa. Independientemente del tipo de sangre que se recoja, los investigadores deben esforzarse por evitar la lisis de los glóbulos rojos (GR). Cuando los glóbulos rojos se lisan, se libera hemoglobina y otros componentes intracelulares^.3 Estas moléculas pueden interferir con la cuantificación basada en EM de otros metabolitos sanguíneos^.4
• Conservar las muestras a -80 °C. Las muestras deben almacenarse lo antes posible a -80 °C tras su recogida. También deben almacenarse como alícuotas en tubos de muestras separados para minimizar los ciclos de congelación-descongelación que pueden alterar el metaboloma sanguíneo^.5

Metabolitos en orina

La orina se compone de moléculas hidrosolubles como la urea, iones, toxinas y otros productos de desecho que los riñones extraen del torrente sanguíneo. La orina también tiene un bajo recuento de células, lo que reduce el ruido biológico en el metaboloma de la orina^.6 También son fáciles de recoger, ya que la orina se puede obtener en casa o en el laboratorio. A pesar de estas ventajas, hay que tener en cuenta ciertas consideraciones a la hora de procesar las muestras de orina:

• Alto contenido en sal. Las muestras de orina pueden contener altas concentraciones de sal que inducen la formación de aductos durante la EM. La presencia de múltiples aductos juntos puede reducir la sensibilidad para detectar metabolitos en las muestras^.7 Por lo tanto, la extracción de muestras debe eliminar las sales interferentes o sus señales deben detectarse y eliminarse durante el análisis de datos^.8
• Puede ser necesaria la dilución de la muestra. Algunos metabolitos muy abundantes, como la urea, pueden enmascarar las señales de EM de metabolitos poco abundantes. En tales situaciones, la dilución de la orina aumentará la intensidad de la señal de otros metabolitos de la muestra. Hacer este paso, sin embargo, requiere un paso de normalización para tener en cuenta las diferencias en el volumen de orina, el contenido de agua y la densidad del agua antes y después de la dilución^.9
• Las muestras deben procesarse rápidamente. Los tiempos de procesamiento rápidos son esenciales para generar metabolomas de orina robustos. Esto se debe a que los metabolomas de la orina pueden cambiar muy rápidamente incluso cuando se almacenan a temperaturas tan bajas como 4°C^.10 Si las muestras no pueden procesarse rápidamente, el almacenamiento a -20°C o -80°C puede retener los metabolomas de la orina antes del procesamiento.
• Otras consideraciones. Debe considerarse la eliminación de células, ya que las células epiteliales pueden estar presentes en baja abundancia en la orina. Además, aunque las enzimas pueden estar presentes en la orina, no se recomienda añadir un inhibidor ya que pueden ofuscar las señales de EM de las moléculas endógenas^.11

Metabolitos en heces

Los metabolomas fecales proporcionan una aproximación útil a las actividades del microbioma intestinal y sus vínculos con la salud del huésped, el estilo de vida y la genética^.12 Los intrincados vínculos con la salud digestiva y corporal a través de diversos ejes, como el ^eje intestino-cerebro13 , hacen de los metabolomas fecales un tipo de muestra atractivo para el estudio. El estudio de los metabolomas fecales también conlleva una serie de consideraciones técnicas que afectan a sus protocolos de procesamiento:

• Las heces contienen varias clases de biomoléculas. Aunque la materia fecal es ~75% agua, también contiene una amplia gama de biomoléculas como materia orgánica no digerida, biomasa bacteriana, carbohidratos, grasas, proteínas y gases orgánicos.
• La materia fecal es muy heterogénea. Muchos factores pueden influir en el aspecto y la composición química de la materia fecal. Entre ellos se incluyen la dieta, el estado de salud del paciente, los medicamentos y la genética del huésped^.14 Esto complica los esfuerzos por estandarizar los protocolos de extracción de materia fecal^.15
• Las muestras pueden conservarse a temperatura ambiente. Las muestras fecales pueden almacenarse a temperatura ambiente durante unos días con determinados conservantes. El almacenamiento a largo plazo, sin embargo, requerirá que las muestras se almacenen a -80 °C.

Metabolitos en los tejidos

El estudio de los metabolomas tisulares aporta una serie de conocimientos útiles para la investigación biomédica. Las biopsias de tejidos se utilizan para diagnosticar el cáncer, estudiar la fisiología de los órganos y controlar el estado de las enfermedades. Aunque los tejidos pueden ser menos complejos que otros tipos de muestras, su procesamiento para la investigación metabolómica también requiere una cuidadosa consideración:

• El procesamiento rápido es esencial. El metabolismo celular continúa incluso después de recoger las biopsias^.16 Por lo tanto, las muestras deben procesarse inmediatamente o congelarse en nitrógeno líquido para conservar el metaboloma tisular lo más cerca posible del in situ^.17 Alternativamente, las muestras pueden almacenarse a -80 °C antes del procesamiento.
• Eliminación de contaminantes no tisulares. Las muestras de tejido pueden contener tejido conectivo, grasa y sangre residual que pueden oscurecer el metaboloma del tejido^.18 Cualquier protocolo de extracción con tejidos debe eliminar primero estos componentes mediante enjuague con agua desionizada para evitar la contaminación.
• Los protocolos de extracción dependen del tipo de tejido. Como en el caso de muchos otros tipos de muestras, se han utilizado múltiples disolventes orgánicos diferentes para procesar muestras de tejido bajo el supuesto de que los metabolomas no son selectivos y son reproducibles. Sin embargo, cada tipo de muestra de tejido puede requerir protocolos de extracción únicos^,15 y aunque se han realizado esfuerzos para estandarizar estos protocolos, aún queda mucho por hacer.

Otros tipos de muestras para metabolómica

Aunque los cuatro tipos de muestras descritos anteriormente son los más frecuentemente estudiados en la investigación metabolómica, el análisis metabolómico puede realizarse en cualquier tipo de muestra, siempre que se haya desarrollado un medio para extraer los metabolitos. Otros tipos de muestras y consideraciones para su procesamiento incluyen:

• Medios de cultivo: La investigación in vitro es útil para estudiar la fisiología celular, especialmente en el caso de las células bacterianas. A la hora de comparar metabolomas entre estudios, los investigadores deben tener en cuenta los medios empleados en cada uno de ellos. La selección de los medios puede tener un impacto sustancial en los metabolomas producidos por las células en crecimiento^.18
• Suelo: El suelo es el medio que impulsa el ecosistema mundial. Almacenados como materia orgánica del suelo, los metabolitos del suelo pueden indicar el tipo de suelo, los procesos biogeoquímicos y los efectos de la actividad antropogénica en la salud medioambiental^.19 Los protocolos típicos de extracción del suelo fumigan el suelo con vapores de cloroformo para liberar los metabolitos intracelulares antes de extraer los metabolitos utilizando tampones de extracción con alto contenido en sal^.20 El suelo también contiene compuestos orgánicos volátiles que requieren un protocolo de extracción distinto para estabilizarlos y caracterizarlos^.21
• El agua: Se están descubriendo cientos de nuevas clases de compuestos en el agua, especialmente en las aguas marinas^.22 Sin embargo, los entornos marinos pueden ser muy complejos, dependiendo de los aspectos del ecosistema marino que se estudien^.23 Aunque los protocolos de extracción típicos con disolventes orgánicos funcionan para el agua, tendrán que modificarse dependiendo de los conjuntos de metabolitos que se estudien.

¿Y ahora qué?

Ahora que ya conoce las consideraciones a tener en cuenta a la hora de recoger diferentes tipos de muestras para el análisis metabolómico, vamos a profundizar en la preparación, el almacenamiento y el transporte de las muestras. El máximo cuidado durante estos pasos garantizará metabolomas de la mayor calidad posible para que pueda extraer información procesable de su estudio.

Referencias

1. Yu Z, Kastenmüller G, He Y, et al. Differences between Human Plasma and Serum Metabolite Profiles. PLOS ONE. 2011;6(7):e21230. doi:10.1371/journal.pone.0021230
2. Barri T, Dragsted LO. UPLC-ESI-QTOF/MS and multivariate data analysis for blood plasma and serum metabolomics: Effect of experimental artefacts and anticoagulant. Analytica Chimica Acta. 2013;768:118-128. doi:10.1016/j.aca.2013.01.015
3. Lippi G, Blanckaert N, Bonini P, et al. Haemolysis: an overview of the leading cause of unsuitable specimens in clinical laboratories. Clin Chem Lab Med. 2008;46(6):764-772. doi:10.1515/CCLM.2008.170
4. Searfoss R, Shah P, Ofori-Mensa K, et al. Impact of hemolysis on multi-OMIC pancreatic biomarker discovery to derisk biomarker development in precision medicine studies. Sci Rep. 2022;12:1186. doi:10.1038/s41598-022-05152-8
5. Chen D, Han W, Huan T, Li L, Li L. Effects of Freeze-Thaw Cycles of Blood Samples on High-Coverage Quantitative Metabolomics. Anal Chem. 2020;92(13):9265-9272. doi:10.1021/acs.analchem.0c01610
6. Khamis MM, Adamko DJ, El-Aneed A. Mass spectrometric based approaches in urine metabolomics and biomarker discovery. Revisiones de espectrometría de masas. 2017;36(2):115-134. doi:10.1002/mas.21455
7. Gao S, Zhang ZP, Karnes HT. Sensitivity enhancement in liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometry using derivatization and mobile phase additives. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2005;825(2):98-110. doi:10.1016/j.jchromb.2005.04.021
8. Peng J, Guo K, Xia J, et al. Development of Isotope Labeling Liquid Chromatography Mass Spectrometry for Mouse Urine Metabolomics: Estudio Metabolómico Cuantitativo de Ratones Transgénicos Relacionados con la Enfermedad de Alzheimer. J Proteome Res. 2014;13(10):4457-4469. doi:10.1021/pr500828v
9. Edmands WMB, Ferrari P, Scalbert A. Normalization to specific gravity prior to analysis improves information recovery from high resolution mass spectrometry metabolomic profiles of human urine. Anal Chem. 2014;86(21):10925-10931. doi:10.1021/ac503190m
10. Laparre J, Kaabia Z, Mooney M et al. Impact of storage conditions on the urinary metabolomics fingerprint. Anal Chim Acta. 2017; 951:99-107. doi: 10.1016/j.aca.2016.11.055
11. Emwas AH, Luchinat C, Turano P, et al. Standardizing the experimental conditions for using urine in NMR-based metabolomic studies with a particular focus on diagnostic studies: a review. Metabolomics. 2015;11(4):872-894. doi:10.1007/s11306-014-0746-7
12. Zierer J, Jackson MA, Kastenmüller G, et al. El metaboloma fecal como lectura funcional del microbioma intestinal. Nat Genet. 2018;50(6):790-795. doi:10.1038/s41588-018-0135-7
13. Konjevod M, Nikolac Perkovic M, Sáiz J, Svob Strac D, Barbas C, Rojo D. Metabolomics analysis of microbiota-gut-brain axis in neurodegenerative and psychiatric diseases. Revista de Análisis Farmacéutico y Biomédico. 2021;194:113681. doi:10.1016/j.jpba.2020.113681
14. Rose C, Parker A, Jefferson B, Cartmell E. The Characterization of Feces and Urine: A Review of the Literature to Inform Advanced Treatment Technology. Crit Rev Environ Sci Technol. 2015;45(17):1827-1879. doi:10.1080/10643389.2014.1000761
15. Lin CY, Wu H, Tjeerdema RS, Viant MR. Evaluation of metabolite extraction strategies from tissue samples using NMR metabolomics. Metabolomics. 2007;3(1):55-67. doi:10.1007/s11306-006-0043-1
16. Saoi M, Britz-McKibbin P. New Advances in Tissue Metabolomics: A Review. Metabolites. 2021;11(10):672. doi:10.3390/metabo11100672
17. Want EJ, Masson P, Michopoulos F, et al. Global metabolic profiling of animal and human tissues via UPLC-MS. Nat Protoc. 2013;8(1):17-32. doi:10.1038/nprot.2012.135
18. Daskalaki E, Pillon NJ, Krook A, Wheelock CE, Checa A. The influence of culture media upon observed cell secretome metabolite profiles: The balance between cell viability and data interpretability. Anal Chim Acta. 2018;1037:338-350. doi:10.1016/j.aca.2018.04.034
19. Baldrian P. Lo conocido y lo desconocido en la ecología microbiana del suelo. FEMS Microbiología Ecología. 2019;95(2):fiz005. doi:10.1093/femsec/fiz005
20. Swenson TL, Jenkins S, Bowen BP, Northen TR. Untargeted soil metabolomics methods for analysis of extractable organic matter. Biología y bioquímica del suelo. 2015;80:189-198. doi:10.1016/j.soilbio.2014.10.007
21. Honeker LK, Graves KR, Tfaily MM, Krechmer JE, Meredith LK. The Volatilome: A Vital Piece of the Complete Soil Metabolome. Frontiers in Environmental Science. 2021;9. Consultado el 10 de abril de 2023. https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fenvs.2021.649905
22. Blunt JW, Copp BR, Keyzers RA et al. Productos naturales marinos. Nat Prod Rep. 2016; 33(3):382-431. doi: 10.1039/c5np00156k
23. Bayona LM, de Voogd NJ, y Choi YH. Metabolómica en el estudio de organismos marinos. Metabolomics. 2022, 18(3):17. doi: 10.1007/s11306-022-01874-y