Capítulo 2 - Flujo de trabajo del estudio metabolómico

Primer paso: diseño del estudio

Un resultado de investigación controlado y perspicaz depende en gran medida de la calidad de la preparación de su estudio. Antes de emprender cualquier estudio metabolómico, es de suma importancia diseñar bien el estudio, asegurándose de que las muestras que va a recoger y la forma de recogerlas son apropiadas y capaces de responder a su pregunta científica^.1 Planificar con antelación le ayudará a trazar su presupuesto y evitar la necesidad inesperada de añadir más muestras más adelante o solicitar ampliaciones de financiación. También es importante eliminar, o al menos identificar, las variables externas que puedan afectar a su estudio, de modo que pueda tenerlas en cuenta posteriormente durante el análisis de los datos.

En Metabolon, trabajamos con usted para garantizar tres componentes clave del éxito de un estudio: un objetivo claramente definido, elementos sólidos de diseño del estudio y una potencia de estudio adecuada. Cada estudio que realizamos comienza con una consulta personalizada para comprender plenamente sus objetivos de investigación. A continuación, trabajamos con usted para diseñar un estudio metabolómico teniendo debidamente en cuenta los tipos de muestras, los puntos temporales, las dosis y la gravedad fenotípica o de la enfermedad. Ayudamos a minimizar la variación y el ruido identificando la matriz de muestras ideal para su estudio, garantizando los controles apropiados en el diseño de su estudio y asegurándonos de que su estudio recoge los datos de exposición adecuados (es decir, dosis, momento de la recogida, etc.).

Segundo paso: preparación de la muestra

La preparación de las muestras incluye varios pasos que deben considerarse y llevarse a cabo cuidadosamente para garantizar la obtención de datos de alta calidad a partir de las muestras: recogida, almacenamiento, extracción y preparación para la medición con instrumentación específica^.1

Como veremos con más detalle en el capítulo 4 de esta guía, hay muchos tipos de muestras diferentes que pueden analizarse mediante protocolos metabolómicos, como células en cultivo, tejidos, heces, sangre, orina y sudor. La fuente de muestra que utilice dependerá de su objetivo de investigación; por ejemplo, podría seleccionar heces si desea estudiar el impacto del microbioma intestinal en la adquisición de nutrientes por parte del huésped, muestras de tejido si desea identificar biomarcadores que diferencien tumores primarios y metástasis, o plasma si está analizando cambios sistémicos. Cada tipo de muestra requiere un método único de manipulación y preparación, que depende de si ha seleccionado un enfoque dirigido o no dirigido para su estudio de perfiles metabolómicos.

Metabolon le facilita la recogida y el almacenamiento de muestras mediante nuestro kit gratuito de manipulación de muestras Study Success, personalizado para su estudio. En el kit se incluyen tubos con códigos de barras específicos para su matriz (es decir, biofluidos, muestras sólidas o pellets celulares), un escáner de códigos de barras e instrucciones para enviarnos sus muestras por correo para garantizar que lleguen de forma segura. Si almacena grandes cantidades de muestras en un biorrepositorio o biobanco, trabajamos directamente con su personal para preparar y enviar sus muestras.

Una vez que llegan sus muestras, las almacenamos en congeladores a -80 °C cuidadosamente controlados y respaldados por generadores o en otro tipo de almacenamiento apropiado para las muestras hasta que se procesan. Contamos con los conocimientos y la experiencia necesarios para garantizar que sus muestras, independientemente de su origen, se preparen para el análisis de forma adecuada, tanto si su estudio utiliza un enfoque global no dirigido, un panel dirigido o una combinación de ambos.

También puede estar seguro de que sus datos se ajustarán a las normas de calidad más exigentes: nuestros laboratorios cuentan con la certificación ISO 9001:2015 para pruebas analíticas y diagnósticas de muestras biológicas y con la certificación CLIA y la acreditación del Colegio de Patólogos Americanos (CAP) para pruebas diagnósticas de muestras humanas.

Tercera etapa: Análisis de muestras

Una vez procesadas las muestras, el siguiente paso es extraer información sobre los metabolitos y las rutas metabólicas presentes en las muestras utilizando la instrumentación adecuada para el diseño de su estudio. Como describimos en el capítulo 1 de esta guía, existen dos enfoques principales para el análisis de metabolitos: la resonancia magnética nuclear (RMN) y la espectrometría de masas (EM). Dado que la EM es más sensible que la RMN^,1,4 suele ser la herramienta elegida para los estudios metabolómicos.

Mediante la espectrometría de masas, las pequeñas moléculas presentes en las muestras se ionizan en una fuente de iones y, a continuación, se detectan en un detector de masas acoplado. Estas pequeñas moléculas pueden introducirse en el espectrómetro de masas mediante infusión directa o, más comúnmente, a través de un sistema cromatográfico acoplado^.1 La cromatografía de gases (GC) y la cromatografía líquida (LC) se han utilizado durante años para analizar pequeñas moléculas; sin embargo, la LC-MS está ganando popularidad porque puede identificar y medir una gama más amplia de compuestos que la GC-MS, y la preparación de muestras es más sencilla^.5

La plataforma de metabolómica LC-MS patentada de Metabolonestá preparada para detectar más metabolitos únicos que cualquier otra plataforma disponible, lo que garantiza que pueda extraer el máximo conocimiento biológico posible de sus muestras. También disponemos de una gama de paneles optimizados, dirigidos y no dirigidos, y ensayos de un solo analito que cubren miles de metabolitos y lípidos en una amplia gama de clases bioquímicas, rutas metabólicas y procesos fisiológicos. Nuestros paneles dirigidos cuentan con métodos precisos y totalmente validados para una cuantificación absoluta. Y si no tenemos un ensayo que pueda responder a su pregunta de investigación, nuestros científicos expertos trabajarán con usted para desarrollar un ensayo personalizado para sus necesidades.

Cuarto paso: Adquisición, tratamiento, análisis e interpretación de datos

El resultado de los espectrómetros de masas suele ser una matriz (es decir, una gran tabla llena de filas y columnas) en la que se enumeran los picos/señales que representan los compuestos presentes en la muestra. Se presentan como m/z, es decir, la relación entre la masa y la carga de cada compuesto^.1 La clave es extraer información biológica significativa de esta tabla, lo que puede ser una tarea desalentadora para cualquiera que no esté familiarizado con los resultados de los datos de espectrometría de masas y las herramientas que pueden utilizarse para analizarlos. Corregir y/o eliminar el ruido es necesario para el análisis de los datos y, posteriormente, para una interpretación precisa que conduzca a una visión procesable.

El equipo de expertos de Metabolontiene décadas de experiencia en el análisis e interpretación de datos LC-MS. Mientras que Metabolon entrega a cada cliente una Tabla de Datos de Cliente formateada que está lista para la importación y el análisis con herramientas de terceros como R y Python, los paneles Global Discovery vienen además con acceso continuo al portalMyMetabolon , donde se puede encontrar la interpretación personalizada de nuestros directores de estudio de nivel de doctorado, las pruebas estadísticas que realizaron, herramientas de visualización de datos totalmente personalizables, un resumen completo de las ideas procesables y los próximos pasos recomendados. Además, el panel Complex Lipid Targeted incluye acceso a la herramienta de visualización de datos Surveyor.

A menudo trabajamos con los clientes después de la interpretación y entrega inicial de datos para ayudarles a analizar sus conjuntos de datos con mayor profundidad y a diseñar y ejecutar estudios de seguimiento. Estos esfuerzos de colaboración han dado lugar a la publicación de más de 3.000 presentaciones y publicaciones científicas. Estas colaboraciones son fructíferas porque cuando usted trabaja con Metabolon, no está trabajando con un proveedor de pago por servicio; está trabajando con un equipo de científicos con formación de doctorado deseosos de ayudarle a descubrir nuevos e interesantes descubrimientos científicos.

¿Y ahora qué?

En este capítulo, hemos analizado algunos de los componentes clave para el éxito del flujo de trabajo de un estudio metabolómico, incluidas las consideraciones clave para el diseño del estudio, la preparación de las muestras, así como el análisis y la interpretación de los datos. En el siguiente capítulo de esta guía, nos adentraremos en los pormenores del diseño de un estudio metabolómico, que incluye cómo definir el propósito del estudio, seleccionar un enfoque experimental adecuado, determinar el tamaño del estudio, seleccionar controles, garantizar que el estudio tenga la potencia adecuada y establecer las expectativas apropiadas de los resultados.

Referencias

1. https://www.ebi.ac.uk/training/online/courses/metabolomics-introduction/designing-a-metabolomics-study/design-experiment/
2. https://www.metabolon.com/working-with-us/study-design-consulting/
3. https://www.metabolon.com/working-with-us/sample-handling-kit/
4. Marshall DD y Powers R. Más allá del paradigma: Combinación de espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear para metabolómica. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc 2017; 100: 1-16. doi: 10.1016/j.pnmrs.2017.01.001.
5. Pérez ER, Knapp JA, Horn CK et al. Comparación del análisis LC-MS-MS y GC-MS de compuestos de benzodiazepina incluidos en el programa de análisis de orina para la reducción de la demanda de drogas. J Anal Toxicol 2016; 40(3): 201-207. doi: 10.1093/jat/bkv140
6. https://www.metabolon.com/services/discover/
7. https://www.metabolon.com/services/target/
8. https://www.metabolon.com/services/target/#singleanalyte
9. https://www.metabolon.com/resources/webinars/client-data-table/
10. https://www.metabolon.com/resources/videos/mymetabolon-portal/
11. https://www.metabolon.com/working-with-us/reporting-interpretation/
12. https://www.metabolon.com/publications