Tipos de muestras para metabolómica

Metabolitos en sangre

La sangre humana contiene cientos de metabolitos que actúan como útiles herramientas de diagnóstico de la salud de una persona. Recoger muestras de sangre puede parecer un proceso trivial, pero hay que tener en cuenta varias consideraciones importantes a la hora de tomar y procesar muestras de sangre:

• Las muestras de sangre pueden procesarse como plasma o suero. El plasma y el suero se obtienen de la porción líquida de la sangre una vez extraídas las células. El suero es la porción líquida después de que se haya producido la coagulación, mientras que el plasma es la porción líquida que queda después de añadir un anticoagulante. Ambos tipos de muestras producen metabolomas similares^,1 pero ciertos anticoagulantes como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o el citrato^,2 pueden aparecer en los metabolomas del plasma. Es menos probable que la heparina interfiera con las señales de espectrometría de masas (EM). Considere cuidadosamente qué anticoagulante va a utilizar si está estudiando plasma y asegúrese de que dispone de un plan para eliminar la señal de fondo durante el análisis de datos, si fuera necesario.
• Evite la hemólisis a toda costa. Independientemente del tipo de sangre que se recoja, los investigadores deben esforzarse por evitar la lisis de los glóbulos rojos (GR). Cuando los glóbulos rojos se lisan, se libera hemoglobina y otros componentes intracelulares^.3 Estas moléculas pueden interferir con la cuantificación basada en EM de otros metabolitos sanguíneos^.4
• Conservar las muestras a -80 °C. Las muestras deben almacenarse lo antes posible a -80 °C tras su recogida. También deben almacenarse como alícuotas en tubos de muestras separados para minimizar los ciclos de congelación-descongelación que pueden alterar el metaboloma sanguíneo^.5

Metabolitos en orina

Urine consists of water-soluble molecules such as urea, ions, toxins, and other waste products that the kidneys extract from the bloodstream. Urine also has low cell counts, reducing biological noise in the urine metabolome.⁶ They are also easy to collect since urine can be obtained at home or in the laboratory. Despite these benefits, certain considerations need to be made when processing urine samples:

• Alto contenido en sal. Las muestras de orina pueden contener altas concentraciones de sal que inducen la formación de aductos durante la EM. La presencia de múltiples aductos juntos puede reducir la sensibilidad para detectar metabolitos en las muestras^.7 Por lo tanto, la extracción de muestras debe eliminar las sales interferentes o sus señales deben detectarse y eliminarse durante el análisis de datos^.8
• Puede ser necesaria la dilución de la muestra. Algunos metabolitos muy abundantes, como la urea, pueden enmascarar las señales de EM de metabolitos poco abundantes. En tales situaciones, la dilución de la orina aumentará la intensidad de la señal de otros metabolitos de la muestra. Hacer este paso, sin embargo, requiere un paso de normalización para tener en cuenta las diferencias en el volumen de orina, el contenido de agua y la densidad del agua antes y después de la dilución^.9
• Samples must be processed quickly. Fast processing times are essential for generating robust urine metabolomes. This is because urine metabolomes can change very quickly even when stored at temperatures as low as 4°C.¹⁰ If samples cannot be processed quickly, storage at -20°C or -80°C can retain urine metabolomes prior to processing.
• Otras consideraciones. Debe considerarse la eliminación de células, ya que las células epiteliales pueden estar presentes en baja abundancia en la orina. Además, aunque las enzimas pueden estar presentes en la orina, no se recomienda añadir un inhibidor ya que pueden ofuscar las señales de EM de las moléculas endógenas^.11

Metabolitos en heces

Fecal metabolomes provide a useful proxy for the activities of the gut microbiome and their links with host health, lifestyle, and genetics.¹² The intricate links with digestive and bodily health through the various axes such as the gut-brain axis¹³ make fecal metabolomes an appealing sample type to study. Studying fecal metabolomes also comes with a series of technical considerations that affect your processing protocols:

• Las heces contienen varias clases de biomoléculas. Aunque la materia fecal es ~75% agua, también contiene una amplia gama de biomoléculas como materia orgánica no digerida, biomasa bacteriana, carbohidratos, grasas, proteínas y gases orgánicos.
• La materia fecal es muy heterogénea. Muchos factores pueden influir en el aspecto y la composición química de la materia fecal. Entre ellos se incluyen la dieta, el estado de salud del paciente, los medicamentos y la genética del huésped^.14 Esto complica los esfuerzos por estandarizar los protocolos de extracción de materia fecal^.15
• Las muestras pueden conservarse a temperatura ambiente. Las muestras fecales pueden almacenarse a temperatura ambiente durante unos días con determinados conservantes. El almacenamiento a largo plazo, sin embargo, requerirá que las muestras se almacenen a -80 °C.

Metabolitos en los tejidos

El estudio de los metabolomas tisulares aporta una serie de conocimientos útiles para la investigación biomédica. Las biopsias de tejidos se utilizan para diagnosticar el cáncer, estudiar la fisiología de los órganos y controlar el estado de las enfermedades. Aunque los tejidos pueden ser menos complejos que otros tipos de muestras, su procesamiento para la investigación metabolómica también requiere una cuidadosa consideración:

• Quick processing times are essential. Cellular metabolism continues even after biopsies are collected.¹⁶ Therefore, samples should either be processed immediately or flash-frozen in liquid nitrogen to retain the tissue metabolome as close to in situ as possible.¹⁷ Alternatively, samples may be stored at -80°C before processing.
• Removing non-tissue contaminants. Tissue samples can contain connective tissue, fat, and residual blood that can obscure the tissue metabolome.¹⁸ Any extraction protocol with tissues must first remove these components through deionized water rinsing to prevent contamination.
• Extraction protocols depend on the tissue type. As is the case with many other sample types, multiple different organic solvents have been used to process tissue samples under the assumption that metabolomes are non-selective and reproducible. However, each tissue sample type may require unique extraction protocols,¹⁵ and while efforts have been made to standardize these protocols, more work needs to be done.

Otros tipos de muestras para metabolómica

Aunque los cuatro tipos de muestras descritos anteriormente son los más frecuentemente estudiados en la investigación metabolómica, el análisis metabolómico puede realizarse en cualquier tipo de muestra, siempre que se haya desarrollado un medio para extraer los metabolitos. Otros tipos de muestras y consideraciones para su procesamiento incluyen:

• Medios de cultivo: La investigación in vitro es útil para estudiar la fisiología celular, especialmente en el caso de las células bacterianas. A la hora de comparar metabolomas entre estudios, los investigadores deben tener en cuenta los medios empleados en cada uno de ellos. La selección de los medios puede tener un impacto sustancial en los metabolomas producidos por las células en crecimiento^.18
• Suelo: El suelo es el medio que impulsa el ecosistema mundial. Almacenados como materia orgánica del suelo, los metabolitos del suelo pueden indicar el tipo de suelo, los procesos biogeoquímicos y los efectos de la actividad antropogénica en la salud medioambiental^.19 Los protocolos típicos de extracción del suelo fumigan el suelo con vapores de cloroformo para liberar los metabolitos intracelulares antes de extraer los metabolitos utilizando tampones de extracción con alto contenido en sal^.20 El suelo también contiene compuestos orgánicos volátiles que requieren un protocolo de extracción distinto para estabilizarlos y caracterizarlos^.21
• Water: Hundreds of new compound classes are being discovered in water, especially in marine waters.²² However, marine environments can be highly complex, depending on the aspects of the marine ecosystem being studied.²³ While typical extraction protocols with organic solvents work for water, these will have to be modified depending on the sets of metabolites being studied.

¿Y ahora qué?

Now that you understand the considerations to make when collecting different sample types for metabolomics analysis, we’ll take a deep dive into sample prep, storage, and transportation. Utmost care during these steps will ensure the highest quality metabolomes possible so you can extract actionable insights from your study.

Referencias

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3. Lippi G, Blanckaert N, Bonini P, et al. Haemolysis: an overview of the leading cause of unsuitable specimens in clinical laboratories. Clin Chem Lab Med. 2008;46(6):764-772. doi:10.1515/CCLM.2008.170
4. Searfoss R, Shah P, Ofori-Mensa K, et al. Impact of hemolysis on multi-OMIC pancreatic biomarker discovery to derisk biomarker development in precision medicine studies. Sci Rep. 2022;12:1186. doi:10.1038/s41598-022-05152-8
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