Capítulo 4 - Transcriptómica

¿Qué es la transcriptómica?

El transcriptoma es el conjunto de transcritos de ARN producidos por el ^genoma1. El transcriptoma está formado por ARN mensajeros (ARNm) que codifican proteínas, pero también incluye tipos de ARN no ^{codificantes2}. La transcriptómica es la rama de la biología molecular centrada en el estudio exhaustivo del transcriptoma. Esta -ómica se ocupa de los aspectos dinámicos de la expresión génica, ayudando a los investigadores a comprender cómo se regulan y expresan los genes en diferentes células y tejidos en diversas condiciones. El análisis del transcriptoma puede conducir a los científicos a una comprensión más profunda de las funciones celulares y de los complejos mecanismos reguladores que rigen los procesos biológicos.

Tipos de ARN

El ARN desempeña un papel fundamental en el dogma central de la biología molecular, que describe el flujo de información genética dentro de un sistema biológico. El proceso comienza con el ADN, la unidad de almacenamiento de la información genética, que se transcribe en ARN. A continuación, el ARN sirve de molde para la síntesis de proteínas mediante el proceso de traducción. Sin embargo, el ARN no sólo sirve como molécula mensajera (ARNm). Existen varias clases de ARN, cada una con sus propias funciones, como el ARN ribosómico (ARNr), el ARN de transferencia (ARNt), los microARN (miARN) y una amplia gama de ARN no codificantes (ARNnc).

Mientras que el ARNr y el ARNt son importantes para el proceso de traducción, los miARN y los ARN no codificantes largos (lncARN) son cruciales para regular la expresión génica a nivel transcripcional y postranscripcional. Estas moléculas pueden modular la estabilidad del ARNm e influir en la eficiencia traslacional, controlando así la cantidad de proteína producida. Esta capacidad reguladora es esencial para mantener la homeostasis celular y responder a los estímulos ambientales.

Cada una de estas tecnologías tiene sus puntos fuertes y sus limitaciones, y el método o la combinación de métodos que mejor funcione dependerá de la pregunta de investigación específica, el tipo de muestra disponible y la resolución requerida. El desarrollo continuo y la integración de estas tecnologías están impulsando el campo de la transcriptómica, mejorando nuestra comprensión de los sistemas biológicos complejos y los mecanismos de las enfermedades.

¿Cómo se estudia la transcriptómica?

Los avances tecnológicos han hecho evolucionar el estudio de la transcriptómica. A grandes rasgos, las tecnologías pueden clasificarse en microarrays, secuenciación y PCR. Dado que el ARN es menos estable que el ADN, estos enfoques implican la transcripción inversa del ARN en ADN complementario (ADNc) y el posterior análisis del ADNc.

Microarrays

Los microarrays de ADN, una de las primeras herramientas utilizadas en transcriptómica, miden simultáneamente los niveles de expresión de miles de genes. Aunque hoy en día los microarrays se utilizan menos debido a sus limitaciones en cuanto a rango dinámico y detección de secuencias genéticas conocidas, fueron fundamentales en la expansión inicial de la transcriptómica.

ARN secuenciación del ARN (RNA-seq)

Esta técnica que aprovecha las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) de (NGS), se ha convertido en el estándar de la transcriptómica. A diferencia de los microarrays, RNA-Seq no no se basa en secuencias predefinidas. RNA-seq puede detectar nuevos transcritos, variantes de empalme y ARN no codificantes y medir cuantitativamente los niveles de expresión de los transcritos. La alta resolución y sensibilidad de esta tecnología la hacen ideal para detectar transcritos poco abundantes y cambios sutiles en la expresión génica.

Secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq)

Esta extensión de la RNA-seq analiza los transcriptomas de células individuales en lugar de una población en conjunto y es una pieza clave de la multiómica unicelular3^,4. La resolución unicelular permite a los investigadores descubrir nuevos tipos celulares y relaciones de linaje. También permite interrogar la heterogeneidad celular dentro de los tejidos, algo crucial para comprender los tejidos complejos, los procesos de desarrollo y la evolución de los tumores. La transcriptómica unicelular se utiliza actualmente para crear mapas celulares del ^cuerpo humano4.

Transcriptómica espacial

Este conjunto de técnicas mapea espacialmente los datos de expresión génica dentro de los tejidos, lo que resulta esencial para comprender la arquitectura tisular y el microentorno celular. La hibridación in situ fluorescente robusta con error multiplexado (MERFISH) y la secuenciación FISH (seqFISH) pueden localizar miles de dianas de ARN simultáneamente5^,6. Slide-seq es una técnica reciente que utiliza códigos de barras de ADN para generar mapas del transcriptoma de alta resolución en ^tejidos7. Este método proporciona una potente herramienta para estudiar la morfología y la patología de los tejidos junto con la expresión génica.

Secuenciación de isoformas (Iso-seq)

A diferencia de la RNA-Seq convencional, que a menudo requiere el ensamblaje de lecturas cortas, la Iso-seq secuencia moléculas de ADNc de longitud completa, lo que ayuda a identificar y cuantificar diferentes isoformas de ARN producidas por splicing alternativo. Este método, impulsado principalmente por tecnologías de secuenciación de tercera generación como las de Pacific Biosciences y Oxford Nanopore, ofrece una visión completa de la diversidad de transcritos.

PCR cuantitativa de transcripción inversa (qRT-PCR)

Aunque no es una tecnología de alto rendimiento, la qRT-PCR se utiliza ampliamente para validar y cuantificar la expresión de genes seleccionados identificados por otros métodos transcriptómicos. Es muy sensible y específica, lo que la convierte en una herramienta excelente para confirmar los resultados de los análisis de ARN-seq o microarrays.

PCR digital

Similar to qRT-PCR, digital PCR is not high throughput or comprehensive of the entire transcriptome but offers absolute quantification of targeted transcripts and high sensitivity to low abundance targets. Droplet digital PCR (ddPCR), the premiere format of digital PCR, is capable of detecting small (<2-fold) changes in abundance, even with small amounts of the target transcript.

Consideraciones experimentales

Las aplicaciones de la transcriptómica incluyen la investigación biológica, el descubrimiento de fármacos, el diagnóstico y la clasificación de enfermedades, entre otras. Por ejemplo, los patrones de expresión génica relacionados con enfermedades específicas pueden ayudar al diagnóstico precoz y a la aplicación de estrategias de^tratamiento2 y, como parte de la multiómica, constituyen uno de los Objetivos Atrevidos para la Biotecnología y la ^{Biomanufactura} de EE.UU.8. En la investigación oncológica, la transcriptómica se ha utilizado para clasificar la agresividad del cáncer y comprender las vías implicadas en su progresión. En la clínica, se están desarrollando pruebas de laboratorio que miden las fusiones genéticas de ARN para guiar el ^tratamiento del cáncer9.

Cada una de las tecnologías transcriptómicas disponibles tiene sus puntos fuertes y sus limitaciones. La técnica que elija dependerá de su pregunta biológica y de factores como las características de la muestra, los requisitos de precisión y el coste. Por ejemplo, los microarrays para una detección amplia y la qPCR para menos dianas son rentables, mientras que RNA-seq y scRNA-seq ofrecen una cobertura exhaustiva a un precio más elevado. Iso-seq sería más costoso por muestra que otros métodos de secuenciación debido a las tecnologías de secuenciación de lectura larga, pero sería ideal para identificar y medir variantes de empalme. Para una máxima sensibilidad a las variantes diana de baja abundancia, la ddPCR sería una opción eficaz y podría complementar a la RNA-seq para una amplia cobertura. Mientras que los marcadores de expresión génica en scRNA-seq pueden dar especificidad de tipo celular, las técnicas de transcriptómica espacial son su mejor apuesta cuando su pregunta biológica implica tejidos complejos.

Casos de uso de la transcriptómica en la investigación multiómica: Casos prácticos

Modulación metabolómica de la inmunidad adaptativa del huésped en la malaria

La malaria es una grave enfermedad transmitida por mosquitos que infecta a millones de personas cada año, sobre todo en regiones tropicales y subtropicales. El mosquito es un vector del Plasmodium falciparum, un parásito microscópico que infecta los glóbulos rojos del huésped y provoca la respuesta inmunitaria que está detrás de los síntomas característicos asociados a la enfermedad.

En un estudio publicado en Nature Metabolism, los investigadores integraron datos de metabolómica y transcriptómica para comprender mejor la patogénesis de P. falciparum e identificar posibles nuevas dianas terapéuticas10.

Se recogieron muestras antes y después de la infección por malaria de niños de dos grupos étnicos de África Occidental (Gouin y Fulani en Burkina Faso). Utilizando el Global Discovery panel de Metabolon, los investigadores identificaron 92 metabolitos asociados a la parasitemia, lo que puso de relieve cambios significativos en los procesos metabólicos del huésped debidos a la infección, con perturbaciones especialmente importantes en el metabolismo de lípidos y aminoácidos que afectaron al metaboloma de esteroides (Figura 1). En particular, las firmas metabólicas específicas de cada fase diferenciaban entre paludismo agudo y crónico.

Los análisis metabolómicos también revelaron diferencias étnicas, mostrando respuestas metabólicas distintas en los niños Gouin y Fulani, dos grupos étnicos con diferente susceptibilidad a la malaria. El grupo Fulani, menos susceptible, mostró niveles reducidos de metabolitos esteroideos frente al grupo Gouin, más susceptible, que mostró una mayor abundancia de esteroides. El perfil metabólico permitió comprender mejor el papel inmunosupresor de la producción endógena de esteroides durante la infección palúdica, especialmente en el grupo étnico Gouin.

Mediante la transcriptómica, los investigadores relacionaron los esteroides pregnenolona asociados a la parasitemia detectados mediante metabolómica con la disminución de la expresión de genes linfocitarios inmunorreguladores clave en los niños Gouin. Los datos transcriptómicos pusieron de relieve la inhibición de las vías de señalización de las células T durante la infección, lo que sugiere que los esteroides elevados debidos a la infección suprimieron la función de las células T y limitaron la capacidad del sistema inmunitario para combatir la infección. Además, el análisis de correlación cruzada entre los niveles de esteroides y la expresión génica identificó miles de asociaciones significativas entre esteroides y transcritos, lo que indica respuestas coordinadas específicas de la infección.

Este estudio ejemplifica cómo la transcriptómica puede vincular los cambios en la expresión génica a perturbaciones metabólicas específicas observadas durante la infección mediante el uso de la multiómica, incluido el análisis metabolómico, y proporciona una comprensión más profunda de la interacción huésped-parásito.

La integración de la metabolómica y la transcriptómica revela nuevos biomarcadores en sangre para el diagnóstico de la tuberculosis en niños.

En un estudio publicado en Scientific Reports, los investigadores aprovecharon los datos de la metabolómica y la transcriptómica para obtener nuevos y valiosos conocimientos sobre el diagnóstico y el tratamiento de la tuberculosis^{pediátrica11.}

Se recogieron muestras de niños con infecciones activas y de miembros del mismo hogar que habían estado expuestos pero que no experimentaban una infección activa. El análisis metabolómico del plasma reveló firmas metabólicas únicas asociadas con las infecciones activas de tuberculosis. Los algoritmos informáticos revelaron tres metabolitos clave -N-acetilneuraminato (AUC 0,66 en el momento del diagnóstico), quinolinato (AUC 0,77 al mes de tratamiento) y piridoxato (AUC 0,87 después del tratamiento)- que identificaron correctamente el estado de la enfermedad en diferentes momentos del tratamiento. Además, cuatro metabolitos (gamma-glutamilalanina, gamma-glutamilglicina, glutamina y piridoxato) identificaron correctamente la respuesta al tratamiento (AUC 0,86).

Los datos transcriptómicos complementaron estos hallazgos, permitiendo correlacionar los cambios metabólicos con la expresión génica (véase la Figura 1). Por ejemplo, los investigadores descubrieron que el N-acetilneuraminato está asociado a interacciones inmunorreguladoras entre células linfoides y no linfoides, mientras que el piridoxato está vinculado a genes metabólicos regulados por p53 y a la traducción mitocondrial, lo que aporta nuevos conocimientos sobre la desregulación metabólica en la tuberculosis pediátrica.

La evaluación multiómica de las alteraciones metabólicas en la esclerosis múltiple identifica cambios en el metabolismo de los aminoácidos aromáticos

Los investigadores combinaron análisis metabolómicos y transcriptómicos en una cohorte de pacientes con esclerosis múltiple (EM) para identificar asociaciones clave entre los cambios de metabolitos y la función de las células inmunitarias humanas en la ^EM12.

En una cohorte de más de 600 pacientes con EM y más de 300 controles sanos, el análisis metabolómico reveló una firma metabólica única en la EM (Figura 3). En concreto, metabolitos como el fenilactato, el 3-(4-hidroxifenil)-lactato y el indolelactato se redujeron significativamente, mientras que otros como el sulfato de p-cresol y la fenilacetilglutamina aumentaron. De forma significativa, los cambios en el metabolismo de los aminoácidos aromáticos (AAA) se asociaron a una reducción de los metabolitos inmunomoduladores y a un aumento de la producción de metabotoxinas.

La integración de los datos de transcriptómica reveló que estos cambios en los metabolitos estaban relacionados con cambios funcionales en las células inmunitarias, que conducían a una mayor producción de citocinas proinflamatorias y a una endocitosis alterada en los monocitos, lo que podría contribuir a la patogénesis y progresión de la EM. Estas asociaciones funcionales fueron confirmadas por la endocitosis monocítica alterada y la producción de citoquinas proinflamatorias tras el tratamiento con metabolitos derivados de AAA in ^vitro12.

El enfoque multiómico utilizado en este estudio subraya las ventajas de integrar la metabolómica y la transcriptómica al proporcionar una comprensión global de la desregulación metabólica en la EM y su impacto en la función de las células inmunes. Este análisis integrado ofrece información valiosa sobre posibles dianas terapéuticas y biomarcadores de la gravedad de la enfermedad en la esclerosis múltiple.

Transcriptómica en un flujo de trabajo multiómico

La transcriptómica tiende un puente entre los datos genómicos estáticos y la dinámica funcional observada en los conjuntos de datos proteómicos y metabolómicos. Este vínculo crucial entre genotipo y fenotipo ayuda a dilucidar los mecanismos por los que la información genética se traduce en resultados funcionales. Los datos temporales proporcionados por la transcriptómica, que captan los rápidos cambios en la expresión génica en respuesta a estímulos, añaden una dimensión vital a los estudios multiómicos, esencial para comprender los procesos de desarrollo, la progresión de las enfermedades y la respuesta a los tratamientos.

Referencias

1. Hoja informativa sobre el transcriptoma. Consultado el 23 de julio de 2024. https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Transcriptome-Fact-Sheet
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8. Oficina de Política Científica y Tecnológica de la Casa Blanca. Bold Goals for U.S. Biotechnology and Biomanufacturing: Harnessing Research and Development to Further Societal Goals. Consultado el 25 de enero de 2024. https://www.whitehouse.gov/wp-content/uploads/2023/03/Bold-Goals-for-U.S.-Biotechnology-and-Biomanufacturing-Harnessing-Research-and-Development-To-Further-Societal-Goals-FINAL.pdf
9. FoundationOne®RNA. Foundation Medicine. Consultado el 23 de julio de 2024. https://www.foundationmedicine.com/test/foundationone-rna
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12. Fitzgerald KC, Smith MD, Kim S, et al. Multi-omic evaluation of metabolic alterations in multiple sclerosis identifies shifts in aromatic amino acid metabolism. Cell Reports Medicine. 2021;2(10):100424. doi:10.1016/j.xcrm.2021.100424