Capítulo 5 - Proteómica

¿Qué es la proteómica?

La proteómica es el estudio exhaustivo del proteoma: todo el complemento de proteínas, incluidas sus variaciones y modificaciones, producido por un organismo o ^sistema1. Este campo complementa la genómica y la transcriptómica para sondear el dogma central de la biología a nivel proteínico. La comprensión de las complejas interacciones de las proteínas, especialmente en el contexto de la regulación génica, abre oportunidades para entender la salud y la enfermedad y mejorar el diagnóstico, el tratamiento y la prevención de las enfermedades.

Las proteínas son fundamentales para los sistemas biológicos, ya que desempeñan funciones esenciales para la vida, como catalizar reacciones metabólicas, replicar el ADN, responder a estímulos y transportar moléculas de un lugar a otro. Las proteínas intervienen en prácticamente todos los procesos de una ^célula2: las proteínas estructurales, como el colágeno y la queratina, proporcionan un andamiaje para organizar las células y los tejidos; las hormonas proteicas, las citocinas y las quimiocinas transmiten mensajes entre las células y los órganos utilizando receptores proteicos para recibir estas señales; y los anticuerpos protegen al organismo de agentes patógenos uniéndose a dianas específicas. Las proteínas también regulan la expresión génica y la actividad de otras proteínas, lo que demuestra su papel crucial en la homeostasis y la regulación génica.

¿Cómo estudiamos la proteómica?

La proteómica utiliza diversas tecnologías sofisticadas. Estas tecnologías son fundamentales para analizar la estructura, la función y las interacciones de las proteínas, proporcionando información crucial para comprender los procesos celulares y los mecanismos de las enfermedades. Estas son algunas de las tecnologías clave que han desempeñado un papel crucial en la obtención de información valiosa a partir de la proteómica:

Espectrometría de masas

La espectrometría de masas es la piedra angular de la proteómica3^,4, ya que permite identificar y cuantificar las proteínas a partir de muestras biológicas. Funciona fragmentando e ionizando las proteínas y, a continuación, midiendo la relación masa-carga de las partículas ionizadas para determinar el peso molecular de los péptidos y las proteínas. Un flujo de trabajo típico implica digerir las proteínas en péptidos, que luego tendrían una "huella dactilar" de espectro de masas característica. Existen tres tipos principales de espectrometría de masas:

• MALDI-TOF (Desorción Láser Asistida por Matriz/Tiempo de Vuelo de Ionización): Utiliza un láser para ionizar fragmentos peptídicos sobre un sustrato, creando fragmentos peptídicos ionizados que llegan a un detector que utiliza el tiempo de vuelo para medir la relación masa-carga (a menor relación masa-carga menor tiempo de vuelo⁾⁵. MALDI-TOF es útil para la identificación rápida de proteínas generando huellas de masa peptídica sin interferencias de otras biomoléculas o sustratos.
• ESI-MS (espectrometría de masas por ionización de electrospray): A menudo acoplada a la cromatografía líquida (LC-ESI-MS/MS), proporciona información detallada sobre las secuencias peptídicas y las modificaciones postraduccionales porque no fragmenta el analito en iones más ^pequeños6.
• MS en tándem (MS/MS): permite secuenciar péptidos fragmentándolos y deducir la secuencia de aminoácidos analizando los fragmentos ^resultantes7.

Cromatografía

Las técnicas cromatográficas se utilizan para separar proteínas y péptidos antes del análisis, que a menudo incluye la EM. Entre ellas se incluyen:

• Cromatografía líquida (CL)⁴: Especialmente útil por su capacidad para separar miles de proteínas y péptidos en una sola pasada.
• Cromatografía de intercambio ^iónico8: separa las proteínas en función de su carga.
• Cromatografía de ^afinidad9: se dirige a proteínas y péptidos específicos con gran especificidad utilizando ligandos que se unen a una estructura o motivo proteico concreto.

Espectrometría de masas por imagen

La espectrometría de masas por imágenes (IMS) permite visualizar la distribución espacial de proteínas y péptidos directamente en los ^tejidos biológicos10. Otras variantes, como la nanoespectroscopia de iones secundarios (NanoSIMS), permiten la localización subcelular de ^{metabolitos11}. Esta técnica tiene importantes aplicaciones en la investigación clínica, como la cartografía de márgenes tumorales o la comprensión de la patología de enfermedades a nivel ^molecular12.

Electroforesis en gel bidimensional (2D-GE)

La 2D-GE es una potente técnica que separa las proteínas en una matriz de gel en función de su punto isoeléctrico y su peso ^molecular13. Este método es útil para visualizar las diferencias de expresión de proteínas en diversas muestras, como la comparación de tejidos enfermos con controles sanos. La electroforesis en gel diferencial 2D (2D-DIGE) es una variación de la 2D-GE que añade etiquetas fluorescentes a dos o más muestras para proporcionar un método barato de comparar proteomas14^,15. Los puntos de interés en los geles DIGE pueden extraerse y caracterizarse mediante espectrometría de masas.

Microarrays de proteínas

Los microarrays de proteínas inmovilizan proteínas en una superficie sólida, lo que permite el análisis paralelo de muchas ^{interacciones16}. Estas matrices pueden utilizarse para la caracterización de anticuerpos, la identificación de enzimas-sustratos y el análisis de interacciones proteína-proteína.

Consideraciones experimentales

Estas tecnologías ofrecen una visión única del proteoma en diversas condiciones fisiológicas y patológicas. La elección de las técnicas dependerá de la cuestión biológica, ya que sus requisitos de coste, resolución, sensibilidad, preparación y análisis variarán. Las técnicas pueden combinarse para gestionar la profundidad y amplitud de los conocimientos. Por ejemplo, la espectrometría de masas se utiliza con frecuencia para identificar los interactores de una proteína específica o los cambios globales en respuesta a una perturbación.

Sin embargo, la EM requiere grandes cantidades de proteína de partida y conocimientos bioinformáticos para su ejecución y análisis. Por otro lado, la electroforesis en gel 2D puede utilizarse para obtener una instantánea del proteoma de forma rápida y económica; la comparación de dos proteomas mediante DIGE puede ayudar a centrarse en diferencias específicas, pero no sería sensible a las proteínas de baja abundancia. La IMS es una técnica bastante nueva que no deja de avanzar y que ahora permite realizar análisis de metabolitos celulares localizados en orgánulos, lo que posibilita un sondeo más profundo del funcionamiento interno de la célula.

Usos modernos de la proteómica en multiómica: Casos prácticos

Metabolon ha trabajado con varios clientes y colaboradores para llevar a cabo una variedad de estudios de investigación multiómica en una amplia gama de temas. A continuación analizamos algunos casos prácticos clave que muestran el uso de la proteómica y la metabolómica junto con otros datos ómicos.

La integración de datos multiómicos revela que el metaboloma es el principal predictor del microambiente cervicovaginal

En una investigación multiómica a gran escala que combinaba datos de microbiómica, metabolómica e inmunoproteómica, los investigadores exploraron las complejas interacciones que se producen en el microambiente cervicovaginal de las mujeres con neoplasia ^cervical17. Integrando estos conjuntos de datos, desarrollaron modelos predictivos de la salud vaginal. En su trabajo, publicado en PLoS Computational Biology, utilizaron muestras cervicovaginales recogidas de 72 mujeres con carcinoma cervicouterino invasivo (CCI [n=8]), lesiones intraepiteliales de bajo y alto grado (HSIL [n=27], LSIL [n=10]) y controles positivos para el VPH (n=18) y negativos para el VPH (n=9) (Figura 1).

Se utilizaron técnicas de aprendizaje automático (redes neuronales y clasificadores de bosque aleatorio) para analizar datos sobre el microbioma, el metaboloma, el proteoma y el pH vaginal con el fin de identificar posibles biomarcadores predictivos del cáncer y el sistema inmunitario. Entre sus resultados, hallaron que los lípidos (por ejemplo, esfingolípidos y ácidos grasos insaturados de cadena larga) eran fuertes predictores de la inflamación genital. En cambio, los metabolitos de aminoácidos predecían la composición del microbioma vaginal y el pH vaginal. Las proteínas inmunitarias clave (IL-6, IL-10, MIP-1α) se asociaron fuertemente con la microbiota vaginal, el pH vaginal (MIF) y la inflamación genital.

La integración de datos de microbiomas, metabolomas e inmunoproteomas ofreció en general modelos más precisos que una sola modalidad ómica, lo que subraya el beneficio de la multiómica integral. Este enfoque integral proporcionó una visión holística del microentorno cervicovaginal, revelando complejas interconexiones entre diferentes capas biológicas que pueden servir como biomarcadores para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer cervicouterino.

Caracterización proteómica y metabolómica de sueros de pacientes con COVID-19

En un estudio publicado en Cell, los investigadores combinaron datos proteómicos y metabolómicos para comprender mejor la gravedad de la enfermedad por COVID-19(Figura 2⁾¹⁸. Recogiendo muestras de suero de 65 pacientes con COVID-19 grave (n=28) o no grave (n=37), pacientes afectados por enfermedades respiratorias no relacionadas con la COVID-19 (n=25) y controles sanos (n=28) para realizar análisis proteómicos y metabolómicos, los investigadores identificaron una desregulación de la función macrófaga, la degranulación plaquetaria y el sistema del complemento, así como una supresión metabólica en pacientes con COVID-19. Además, se correlacionaron 93 proteínas y 204 metabolitos con la gravedad de la enfermedad. Además, 93 proteínas y 204 metabolitos se correlacionaron con la gravedad de la enfermedad.

Los investigadores entrenaron un modelo de aprendizaje automático de bosque aleatorio a partir de datos proteómicos y metabólicos (22 proteínas y 7 metabolitos) de 31 pacientes de COVID-19, 13 de los cuales presentaban una infección grave por COVID-19. La validación de este modelo en cohortes independientes reveló que podía estratificar correctamente a los pacientes en función de la gravedad de la enfermedad en casi el 85% de los casos de prueba. Los autores plantearon la hipótesis de que muchos de estos biomarcadores están implicados en el sistema inmunitario o son indicativos de daños hepáticos que pueden preceder a los síntomas manifiestos de COVID-19 grave. Los autores también descubrieron que estos biomarcadores eran premonitorios de infecciones graves por COVID-19 hasta cuatro días antes de que se manifestaran los síntomas ^graves10.

Desarrollo de un modelo multiómico para la identificación de biomarcadores predictivos de la gravedad de la COVID-19: un estudio de cohortes retrospectivo

En un estudio publicado en Lancet Digital Health, los investigadores combinaron la metabolómica, la lipidómica y la proteómica para identificar biomarcadores predictivos de las complicaciones asociadas a la ^COVID-1919. En una cohorte de 455 pacientes con COVID-19 y 182 controles, los investigadores perfilaron retrospectivamente las citocinas circulantes y otras proteínas, lípidos y metabolitos.

Utilizando modelos avanzados de aprendizaje automático sobre los datos, los investigadores identificaron 102 biomarcadores que predecían eficazmente los resultados clínicos graves en COVID-19. Algunos, como el miembro A de la familia 6 del dominio de la lectina de tipo C (CLEC6A), la fosfatidiletanolamina de éter (P-18:1/18:1) y el 2-hidroxidecanoato(Figura 3), son biomarcadores novedosos que no se habían asociado anteriormente con la gravedad de la COVID-19. Estos descubrimientos ponen de relieve el potencial de los enfoques multiómicos para revelar detalles intrincados sobre los mecanismos de la enfermedad que no se habían encontrado antes. Estos descubrimientos ponen de relieve el potencial de los enfoques multiómicos para revelar detalles intrincados sobre los mecanismos de la enfermedad que los paneles de citocinas tradicionales no pueden proporcionar.

La integración de múltiples conjuntos de datos ómicos no sólo permitió identificar vías y procesos biológicos interconectados, sino que la aplicación de algoritmos de aprendizaje automático condujo a la creación de modelos predictivos que superaron a los basados únicamente en marcadores tradicionales, lo que ilustra el poder de combinar diversos datos biológicos como análisis multiómicos para mejorar la precisión predictiva y profundizar en los conocimientos biológicos.

Proteómica en la investigación multiómica

Estos estudios de casos demostraron la importancia de la proteómica como componente esencial de la investigación multiómica para proporcionar una comprensión holística de los sistemas biológicos y los procesos de enfermedad. La multimedicina desempeña ya un papel clave en el avance de la medicina personalizada, y probablemente seguirá haciéndolo, sobre todo a medida que mejore la tecnología.

Referencias

1. Al-Amrami S, Al-Jabri Z, Al-Zaabi A, et al. Proteomics: Concepts and applications in human medicine. World J Biol Chem. 2021;12(5): 57-69. doi: 10.4331/wjbc.v12.i5.57
2. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of the Cell. 4.ª edición. New York: Garland Science; 2002. Análisis de la estructura y la función de las proteínas. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26820/
3. Han X, Aslanian A, y Yates III JR. Espectrometría de masas para proteómica. Curr Opin Chem Biol. 2008;12(5): 483-490. doi: 10.1016/j.cbpa.2008.07.024
4. Parker CE, Warren MR, Mocanu V. Espectrometría de masas para proteómica. En: Alzate O, editor. Neuroproteomics. Boca Ratón (FL): CRC Press/Taylor & Francis; 2010. Chapter 5. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK56011/
5. Li D, Yi J, Han G, Qiao L. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research. ACS Meas Sci Au. 2022;2(5):385-404. doi:10.1021/acsmeasuresciau.2c00019
6. Pitt JJ. Principios y aplicaciones de la cromatografía líquida-espectrometría de masas en bioquímica clínica. Clin Biochem Rev. 2009;30(1):19-34.
7. Neagu AN, Jayathirtha M, Baxter E, Donnelly M, Petre BA, Darie CC. Applications of tandem mass spectrometry (MS/MS) in protein analysis for biomedical research. Molecules. 2022;27(8):2411. doi:10.3390/molecules27082411
8. Jungbauer A y Hahn R. Cromatografía de intercambio iónico. Methods Enzymol. 2009:463:349-71. doi: 10.1016/S0076-6879(09)63022-6
9. Urh M, Simpson D, y Zhao K. Cromatografía de afinidad: métodos generales. Methods Enzymol. 2009:463:417-38. doi: 10.1016/S0076-6879(09)63026-3
10. McDonnell LA, Heeren RMA. Imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 2007;26(4):606-643. doi:10.1002/mas.20124
11. Siuzdak G. Subcellular quantitative imaging of metabolites at the organelle level. Nat Metab. 2023;5(9):1446-1448. doi:10.1038/s42255-023-00882-z
12. Arentz G, Mittal P, Zhang C, et al. Applications of mass spectrometry imaging to cancer. En: Advances in Cancer Research. Vol 134. Elsevier; 2017:27-66. doi:10.1016/bs.acr.2016.11.002
13. Adams LD y Gallagher SR. Electroforesis bidimensional en gel. Curr Protoc Mol Biol. 2004 Sep:Chapter 10:Unit 10.4. doi: 10.1002/0471142727.mb1004s67
14. Kondo T. Cancer biomarker development and two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE). Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 2019;1867(1):2-8. doi:10.1016/j.bbapap.2018.07.002
15. Meleady P. Electroforesis bidimensional en gel y 2D-DIGE. Methods Mol Biol. 2023;2596:3-15. doi:10.1007/978-1-0716-2831-7_1
16. Reymond Sutandy FX, Qian J, Chen C-S, et al. Overview of Protein Microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 2013; 72(1): 2711-27116. doi: 10.1002/0471140864.ps2701s72
17. Bokulich NA, Łaniewski P, Adamov A, Chase DM, Caporaso JG, Herbst-Kralovetz MM. Multi-omics data integration reveals metabolome as the top predictor of the cervicovaginal microenvironment. Segata N, ed. PLoS Comput Biol. 2022;18(2):e1009876. doi:10.1371/journal.pcbi.1009876
18. Shen B, Yi X, Sun Y, et al. Proteomic and metabolomic characterization of COVID-19 patient sera. Cell. 2020;182(1):59-72.e15. doi:10.1016/j.cell.2020.05.032
19. Byeon SK, Madugundu AK, Garapati K, et al. Development of a multiomics model for identification of predictive biomarkers for COVID-19 severity: a retrospective cohort study. The Lancet Digital Health. 2022;4(9):e632-e645. doi:10.1016/S2589-7500(22)00112-1