Chapitre 4 - Transcriptomique

Qu'est-ce que la transcriptomique ?

Le transcriptome est l'ensemble des transcriptions d'ARN produites par le ^génome1. Le transcriptome se compose de l'ARN messager (ARNm) qui code pour les protéines, mais aussi de types d'ARN non ^codants2. La transcriptomique est la branche de la biologie moléculaire qui se concentre sur l'étude complète du transcriptome. La transcriptomique s'intéresse aux aspects dynamiques de l'expression des gènes et aide les chercheurs à comprendre comment les gènes sont régulés et exprimés dans différentes cellules et tissus, dans diverses conditions. L'analyse du transcriptome peut permettre aux scientifiques de mieux comprendre les fonctions cellulaires et les mécanismes de régulation complexes qui régissent les processus biologiques.

Chacune de ces technologies a ses points forts et ses limites, et la méthode ou la combinaison de méthodes qui fonctionne le mieux dépend de la question de recherche spécifique, du type d'échantillon disponible et de la résolution requise. Le développement et l'intégration continus de ces technologies font progresser le domaine de la transcriptomique, améliorant notre compréhension des systèmes biologiques complexes et des mécanismes pathologiques.

Comment la transcriptomique est-elle étudiée ?

Les progrès technologiques ont fait évoluer l'étude de la transcriptomique. Les technologies peuvent être classées en trois grandes catégories : les microréseaux, le séquençage et les méthodes basées sur la PCR. L'ARN étant moins stable que l'ADN, ces approches impliquent la transcription inverse de l'ARN en ADN complémentaire (ADNc), puis l'analyse de l'ADNc.

Microarrays

Les puces à ADN, l'un des premiers outils utilisés en transcriptomique, mesurent les niveaux d'expression de milliers de gènes simultanément. Bien que les puces soient moins utilisées aujourd'hui en raison de leurs limites en termes de gamme dynamique et de détection de séquences de gènes connues, elles ont joué un rôle essentiel dans l'essor de la transcriptomique.

ARN séquencing (RNA-seq)

Cette technique, en s'appuyant sur Cette technique, qui s'appuie sur les technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS), est devenue la norme en matière de transcriptomique. Contrairement aux biopuces, l'ARN-Seq ne ne repose pas sur des séquences prédéfinies. L'ARN-Seq peut détecter de nouveaux transcrits, des variantes d'épissage et des ARN non codants et mesurer quantitativement les niveaux d'expression des transcrits. La haute résolution et la sensibilité de cette technologie la rendent idéale pour détecter les transcrits peu abondants et les changements subtils dans l'expression des gènes.

Séquençage de l'ARN unicellulaire (scRNA-seq)

Cette extension de l'ARN-seq analyse les transcriptomes de cellules individuelles plutôt que d'une population dans son ensemble et constitue un élément clé de la multiomique unicellulaire3^,4. La résolution unicellulaire permet aux chercheurs de découvrir de nouveaux types de cellules et des relations de lignage. Elle permet également d'interroger l'hétérogénéité cellulaire au sein des tissus, ce qui est essentiel pour comprendre les tissus complexes, les processus de développement et l'évolution des tumeurs. La transcriptomique unicellulaire est actuellement utilisée pour créer des cartes cellulaires du corps ^humain4.

Transcriptomique spatiale

Cet ensemble de techniques permet de cartographier les données d'expression génique dans l'espace à l'intérieur des tissus, ce qui est essentiel pour comprendre l'architecture des tissus et le microenvironnement cellulaire. L'hybridation fluorescente in situ robuste à erreur multiplexée (MERFISH) et l'hybridation fluorescente in situ à séquençage (seqFISH) peuvent localiser simultanément des milliers de cibles d'ARN5^,6. Le Slide-seq est une technique récente qui utilise le codage à barres de l'ADN pour générer des cartes transcriptomiques à haute résolution dans les ^tissus7. Cette méthode constitue un outil puissant pour étudier la morphologie et la pathologie des tissus en conjonction avec l'expression des gènes.

Séquençage des isoformes (Iso-seq)

Contrairement à l'ARN-Seq conventionnel, qui nécessite souvent l'assemblage de courtes lectures, l'Iso-seq séquence des molécules d'ADNc de pleine longueur, ce qui permet d'identifier et de quantifier les différentes isoformes d'ARN produites par l'épissage alternatif. Cette méthode, qui s'appuie principalement sur des technologies de séquençage de troisième génération telles que celles de Pacific Biosciences et d'Oxford Nanopore, offre une vue complète de la diversité des transcrits.

PCR quantitative par transcription inverse (qRT-PCR)

Bien qu'il ne s'agisse pas d'une technologie à haut débit, la qRT-PCR est largement utilisée pour valider et quantifier l'expression de gènes sélectionnés identifiés par d'autres méthodes transcriptomiques. Elle est très sensible et spécifique, ce qui en fait un excellent outil pour confirmer les résultats des analyses RNA-seq ou microarray.

PCR numérique

Similar to qRT-PCR, digital PCR is not high throughput or comprehensive of the entire transcriptome but offers absolute quantification of targeted transcripts and high sensitivity to low abundance targets. Droplet digital PCR (ddPCR), the premiere format of digital PCR, is capable of detecting small (<2-fold) changes in abundance, even with small amounts of the target transcript.

Considérations expérimentales

Les applications de la transcriptomique comprennent la recherche biologique, la découverte de médicaments, le diagnostic et la classification des maladies, etc. Par exemple, les modèles d'expression génique liés à des maladies spécifiques peuvent contribuer au diagnostic précoce et à la mise en œuvre de stratégies de^traitement2 et, en tant qu'élément de la multiomique, constituent l'un des objectifs audacieux de la biotechnologie et de la biofabrication aux ^États-Unis8. Dans la recherche sur le cancer, la transcriptomique a été utilisée pour classer l'agressivité du cancer et comprendre les voies impliquées dans la progression. En clinique, des tests mis au point en laboratoire et mesurant les fusions de gènes ARN sont en cours d'élaboration pour guider le traitement du ^cancer9.

Chacune des technologies transcriptomiques disponibles présente des avantages et des inconvénients. La technique que vous choisirez dépendra de votre question biologique et de facteurs tels que les caractéristiques de l'échantillon, les exigences de précision et le coût. Par exemple, les puces à ADN pour une détection étendue et la qPCR pour un nombre réduit de cibles sont rentables, tandis que l'ARN-seq et l'ARN-sc offrent une couverture complète à un prix plus élevé. L'Iso-seq serait plus coûteux par échantillon que les autres méthodes de séquençage en raison des technologies de séquençage à lecture longue, mais serait idéal pour identifier et mesurer les variantes d'épissage. Pour une sensibilité maximale aux variants cibles de faible abondance, la ddPCR serait un choix efficace et pourrait compléter l'ARN-seq pour une large couverture. Alors que les marqueurs d'expression génique dans le scRNA-seq peuvent donner une spécificité de type cellulaire, les techniques de transcriptomique spatiale sont votre meilleur atout lorsque votre question biologique implique des tissus complexes.

Cas d'utilisation de la transcriptomique dans la recherche multiomique : Études de cas

Modulation métabolique de l'immunité adaptative de l'hôte dans le paludisme

Le paludisme est une maladie grave transmise par les moustiques qui infecte des millions de personnes chaque année, principalement dans les régions tropicales et subtropicales. Le moustique est un vecteur de Plasmodium falciparum, un parasite microscopique qui infecte les globules rouges de l'hôte et provoque la réaction immunitaire à l'origine des symptômes caractéristiques de la maladie.

Dans une étude publiée dans Nature Metabolism, des chercheurs ont intégré des données métabolomiques et transcriptomiques pour mieux comprendre la pathogenèse de P. falciparum et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles10.

Des échantillons ont été prélevés avant et après l'infection par le paludisme chez des enfants appartenant à deux groupes ethniques d'Afrique de l'Ouest (Gouin et Fulani au Burkina Faso). En utilisant le Global Discovery panel de Metabolon, les chercheurs ont identifié 92 métabolites associés à la parasitémie, mettant en évidence des changements significatifs dans les processus métaboliques de l'hôte dus à l'infection, avec en particulier des perturbations majeures dans le métabolisme des lipides et des acides aminés qui ont affecté le métabolome des stéroïdes (Figure 1). Les signatures métaboliques spécifiques à chaque stade ont notamment permis de différencier le paludisme aigu du paludisme chronique.

Les différences ethniques ont également été révélées par les analyses métabolomiques, qui ont montré des réponses métaboliques distinctes chez les enfants Gouin et Fulani, deux groupes ethniques présentant une susceptibilité différente au paludisme. Le groupe Fulani, moins sensible, présentait des niveaux réduits de métabolites stéroïdiens, alors que le groupe Gouin, plus sensible, présentait une abondance accrue de stéroïdes. Le profilage métabolique a permis de mieux comprendre le rôle immunosuppresseur de la production de stéroïdes endogènes au cours de l'infection palustre, en particulier dans le groupe ethnique Gouin.

En utilisant la transcriptomique, les chercheurs ont établi un lien entre les stéroïdes de prégnénolone associés à la parasitémie et détectés par la métabolomique, et la diminution de l'expression des gènes clés des lymphocytes immunorégulateurs chez les enfants Gouin. Les données transcriptomiques ont mis en évidence l'inhibition des voies de signalisation des lymphocytes T pendant l'infection, suggérant que l'augmentation des stéroïdes due à l'infection supprimait la fonction des lymphocytes T et limitait la capacité du système immunitaire à combattre l'infection. En outre, l'analyse de corrélation croisée entre les niveaux de stéroïdes et l'expression des gènes a permis d'identifier des milliers d'associations significatives entre stéroïdes et transcriptions, indiquant des réponses coordonnées spécifiques à l'infection.

Cette étude montre comment la transcriptomique peut relier les changements d'expression génique à des perturbations métaboliques spécifiques observées au cours de l'infection à l'aide de la multiomique, y compris l'analyse métabolomique, et permet de mieux comprendre l'interaction hôte-parasite.

L'intégration de la métabolomique et de la transcriptomique révèle de nouveaux biomarqueurs dans le sang pour le diagnostic de la tuberculose chez les enfants.

Dans une étude publiée dans Scientific Reports, des chercheurs ont exploité des données métabolomiques et transcriptomiques pour obtenir de nouvelles informations précieuses sur le diagnostic et le traitement de la tuberculose^{pédiatrique11}.

Des échantillons ont été prélevés sur des enfants atteints d'infections actives et sur des membres du même foyer qui avaient été exposés mais ne présentaient pas d'infection active. L'analyse métabolomique du plasma a révélé des signatures métaboliques uniques associées aux infections tuberculeuses actives. Des algorithmes informatiques ont révélé trois métabolites clés - le N-acétylneuraminate (AUC 0,66 au moment du diagnostic), le quinolinate (AUC 0,77 après un mois de traitement) et le pyridoxate (AUC 0,87 après le traitement) - qui ont permis d'identifier correctement l'état de la maladie à différents moments au cours du traitement. En outre, quatre métabolites (gamma-glutamylalanine, gamma-glutamylglycine, glutamine et pyridoxate) ont permis d'identifier la réponse au traitement (AUC 0,86).

Les données transcriptomiques ont complété ces résultats, permettant de corréler les changements métaboliques avec l'expression des gènes (voir figure 1). Par exemple, les chercheurs ont découvert que le N-acétylneuraminate est associé aux interactions immunorégulatrices entre les cellules lymphoïdes et non lymphoïdes, tandis que le pyridoxate est lié aux gènes métaboliques régulés par p53 et à la traduction mitochondriale, apportant ainsi de nouvelles connaissances sur la dysrégulation métabolique dans la tuberculose pédiatrique.

L'évaluation multiomique des altérations métaboliques dans la sclérose en plaques identifie des changements dans le métabolisme des acides aminés aromatiques

Les chercheurs ont combiné des analyses métabolomiques et transcriptomiques dans une cohorte de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) afin d'identifier des associations clés entre les changements de métabolites et la fonction des cellules immunitaires humaines dans la ^SEP12.

Dans une cohorte de plus de 600 patients atteints de SEP et de plus de 300 témoins sains, l'analyse métabolomique a révélé une signature métabolique unique dans la SEP (Figure 3). Plus précisément, des métabolites tels que le phényllactate, le 3-(4-hydroxyphényl)-lactate et l'indolelactate ont été significativement réduits, tandis que d'autres, tels que le sulfate de p-crésol et la phénylacétylglutamine, ont été augmentés. De manière significative, les changements dans le métabolisme des acides aminés aromatiques (AAA) ont été associés à une réduction des métabolites immunomodulateurs et à une augmentation de la production de métabotoxines.

L'intégration des données transcriptomiques a révélé que ces changements métaboliques étaient liés à des changements fonctionnels dans les cellules immunitaires, conduisant à une production accrue de cytokines pro-inflammatoires et à une endocytose altérée dans les monocytes, ce qui pourrait contribuer à la pathogenèse et à la progression de la sclérose en plaques. Ces associations fonctionnelles ont été confirmées par une modification de l'endocytose des monocytes et de la production de cytokines pro-inflammatoires après un traitement in vitro par des métabolites dérivés de l'^AAA12.

L'approche multiomique utilisée dans cette étude souligne les avantages de l'intégration de la métabolomique et de la transcriptomique en fournissant une compréhension complète du dérèglement métabolique dans la sclérose en plaques et de son impact sur la fonction des cellules immunitaires. Cette analyse intégrée offre des informations précieuses sur les cibles thérapeutiques potentielles et les biomarqueurs de la gravité de la maladie dans la sclérose en plaques.

Transcriptomique dans un flux de travail multi-comique

La transcriptomique comble le fossé entre les données génomiques statiques et la dynamique fonctionnelle observée dans les ensembles de données protéomiques et métabolomiques. Ce lien crucial entre le génotype et le phénotype aide à élucider les mécanismes par lesquels l'information génétique est traduite en résultats fonctionnels. Les données temporelles fournies par la transcriptomique, qui saisissent les changements rapides dans l'expression des gènes en réponse à des stimuli, ajoutent une dimension vitale aux études multidomiques, essentielles pour comprendre les processus de développement, la progression des maladies et la réponse aux traitements.

Références

1. Fiche d'information sur le transcriptome. Consulté le 23 juillet 2024. https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Transcriptome-Fact-Sheet
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3. Baysoy A, Bai Z, Satija R, Fan R. The technological landscape and applications of single-cell multi-omics. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24(10):695-713. doi:10.1038/s41580-023-00615-w
4. Aldridge S et Teichmann SA. Single cell transcriptomics comes of age. Nat Commun. 2020;11(1):4307. doi:10.1038/s41467-020-18158-5
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6. Shah S, Lubeck E, Zhou W, et al. seqFISH accurately detects transcripts in single cells and reveals robust spatial organization in the hippocampus. Neuron. 2017;94(4):752-758.e1. doi:10.1016/j.neuron.2017.05.008
7. Rodriques SG, Stickels RR, Goeva A, et al. Slide-seq : a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 2019;363(6434):1463-1467. doi:10.1126/science.aaw1219
8. Bureau de la politique scientifique et technologique de la Maison Blanche. Bold Goals for U.S. Biotechnology and Biomanufacturing (Objectifs audacieux pour la biotechnologie et la biofabrication aux États-Unis) : Exploiter la recherche et le développement pour atteindre des objectifs sociétaux. Accessible le 25 janvier 2024. https://www.whitehouse.gov/wp-content/uploads/2023/03/Bold-Goals-for-U.S.-Biotechnology-and-Biomanufacturing-Harnessing-Research-and-Development-To-Further-Societal-Goals-FINAL.pdf
9. FoundationOne®RNA. Foundation Medicine. Consulté le 23 juillet 2024. https://www.foundationmedicine.com/test/foundationone-rna
10. Abdrabou W, Dieng MM, Diawara A, et al. Metabolome modulation of the host adaptive immunity in human malaria. Nat Metab. 2021;3(7):1001-1016. doi:10.1038/s42255-021-00404-9
11. Dutta NK, Tornheim JA, Fukutani KF, et al. L'intégration de la métabolomique et de la transcriptomique révèle de nouveaux biomarqueurs dans le sang pour le diagnostic de la tuberculose chez les enfants. Sci Rep. 2020;10(1):19527. doi:10.1038/s41598-020-75513-8
12. Fitzgerald KC, Smith MD, Kim S, et al. L'évaluation multi-comique des altérations métaboliques dans la sclérose en plaques identifie des changements dans le métabolisme des acides aminés aromatiques. Cell Reports Medicine. 2021;2(10):100424. doi:10.1016/j.xcrm.2021.100424