Procédures expérimentales

Plate-forme Metabolon

Accession aux échantillons

Après réception, les échantillons sont inventoriés et immédiatement stockés à -80°C. Chaque échantillon reçu est enregistré dans le système LIMS de Metabolon et se voit attribuer un identifiant unique associé uniquement à l'identifiant de la source d'origine. Cet identifiant est utilisé pour suivre toutes les manipulations d'échantillons, les tâches, les résultats, etc.

Les échantillons (et tous les aliquots dérivés) sont suivis par le système LIMS à l'aide d'un identifiant unique lorsqu'une nouvelle tâche est créée. Les relations parent-enfant des échantillons sont également suivies. Tous les échantillons sont conservés à -80°C jusqu'à leur traitement.

Préparation de l'échantillon

Les échantillons sont préparés à l'aide du système automatisé MicroLab STAR® de la société Hamilton. Plusieurs étalons de récupération sont ajoutés avant la première étape du processus d'extraction à des fins de contrôle de qualité. Pour précipiter les protéines, dissocier les petites molécules liées aux protéines et récupérer les métabolites chimiquement divers, les échantillons sont mélangés à du méthanol avec une agitation vigoureuse pendant 2 minutes (Glen Mills GenoGrinder 2000) suivie d'une centrifugation.

L'extrait obtenu est divisé en plusieurs fractions : deux pour l'analyse par deux méthodes distinctes de phase inverse (RP)/UPLC-MS/MS avec ionisation par électrospray en mode positif (ESI), une pour l'analyse par RP/UPLC-MS/MS avec ionisation par ESI en mode négatif, et une pour l'analyse par HILIC/UPLC-MS/MS avec ionisation par ESI en mode négatif. Les fractions restantes sont réservées pour la sauvegarde.

Les échantillons sont ensuite placés brièvement sur un TurboVap® (Zymark) pour éliminer le solvant organique. Les extraits d'échantillons sont stockés pendant une nuit sous azote avant d'être préparés pour l'analyse.

Contrôle de la qualité

Plusieurs types de contrôles sont analysés en même temps que les échantillons expérimentaux :

• Un échantillon matriciel commun généré par le prélèvement d'un petit volume de chaque échantillon expérimental (ou alternativement, l'utilisation d'un pool de plasma humain bien caractérisé) sert de réplique technique pour l'ensemble des données.
• Les échantillons d'eau extraite servent de blancs de processus
• Un cocktail d'étalons de contrôle de qualité soigneusement choisis pour ne pas interférer avec la mesure des composés endogènes est ajouté à chaque échantillon analysé, ce qui permet de contrôler les performances de l'instrument et de faciliter l'alignement chromatographique.

Tous les échantillons et étalons de CQ sont répertoriés dans les tableaux 1 et 2.

La variabilité de l'instrument est déterminée en calculant l'écart-type relatif médian (RSD) pour les étalons ajoutés à chaque échantillon avant l'injection dans les spectromètres de masse. La variabilité globale du processus est déterminée en calculant l'écart-type relatif médian pour tous les métabolites endogènes (c'est-à-dire les étalons non instrumentaux) présents dans 100 % des échantillons de matrice regroupés. Les échantillons expérimentaux sont randomisés sur l'ensemble de la plate-forme et les échantillons de contrôle de qualité sont répartis uniformément entre les injections, comme indiqué dans la figure 1 ci-dessous.

Tableau 2 : Normes de contrôle de qualité de Metabolon

Figure 1. Préparation des réplicats techniques spécifiques aux clients. Une petite aliquote de chaque échantillon de client (cylindres colorés) est regroupée pour créer un réplicat technique CMTRX (cylindre multicolore), qui est ensuite injecté périodiquement tout au long de l'exécution de la plate-forme. La variabilité des substances biochimiques détectées de manière cohérente peut être utilisée pour estimer la variabilité du processus et de la plate-forme.

Chromatographie liquide à ultra-haute performance et spectroscopie de masse en tandem (UPLC-MS/MS) :

Toutes les méthodes utilisent une chromatographie liquide ultra-performante (UPLC) Waters ACQUITY et un spectromètre de masse Thermo Scientific Q-Exactive à haute résolution/précision interfacé avec une source d'ionisation par électrospray chauffée (HESI-II) et un analyseur de masse Orbitrap fonctionnant à une résolution de 35 000 masses (PMID : 32445384).

Les extraits d'échantillons séchés sont reconstitués dans des solvants compatibles avec chacune des quatre méthodes. Chaque solvant de reconstitution contient une série d'étalons à des concentrations fixes pour garantir la cohérence de l'injection et de la chromatographie. Une aliquote est analysée dans des conditions d'ions positifs acides, chromatographiquement optimisées pour les composés les plus hydrophiles (PosEarly). Dans cette méthode, l'extrait est élué en gradient sur une colonne C18 (Waters UPLC BEH C18-2,1×100 mm, 1,7 µm) en utilisant de l'eau et du méthanol contenant 0,05 % d'acide perfluoropentanoïque (PFPA) et 0,1 % d'acide formique (FA).

Une deuxième aliquote est également analysée dans des conditions d'ions positifs acides ; cependant, cette aliquote est chromatographiquement optimisée pour des composés plus hydrophobes (PosLate). Dans cette méthode, l'extrait est élué en gradient à partir de la même colonne Waters C18 en utilisant du méthanol, de l'acétonitrile, de l'eau, 0,05 % de PFPA et 0,01 % de FA, avec une teneur en matière organique plus élevée.

Une troisième aliquote est analysée dans des conditions optimisées d'ions négatifs basiques en utilisant une colonne C18 dédiée séparée (Neg). Les extraits basiques sont élués en gradient de la colonne en utilisant du méthanol et de l'eau avec du bicarbonate d'ammonium 6,5mM à pH 8.

Un quatrième aliquote est analysé par ionisation négative après élution sur une colonne HILIC (Waters UPLC BEH Amide 2,1×150 mm, 1,7 µm) à l'aide d'un gradient composé d'eau et d'acétonitrile avec 10mM de formiate d'ammonium, pH 10,8. L'analyse MS alterne entre des scans MS et des scans ^MSn dépendant des données en utilisant l'exclusion dynamique. La plage de balayage varie légèrement d'une méthode à l'autre mais couvre 70-1000 m/z. Les fichiers de données brutes sont archivés et extraits comme décrit ci-dessous.

Bioinformatique

Le système informatique se compose de quatre éléments principaux : le système de gestion de l'information du laboratoire (LIMS), le logiciel d'extraction des données et d'identification des pics, les outils de traitement des données pour le contrôle de qualité et l'identification des composés, et une collection d'outils d'interprétation et de visualisation des informations à l'usage des analystes de données. Les bases matérielles et logicielles de ces composants informatiques sont l'épine dorsale du réseau local et un serveur de base de données fonctionnant sous Oracle 10.2.0.1 Enterprise Edition.

LIMS

L'objectif du système LIMS de Metabolon est de permettre une automatisation des laboratoires entièrement vérifiable grâce à un système sécurisé, facile à utiliser et hautement spécialisé. Le système LIMS de Metabolon englobe l'accès aux échantillons, la préparation des échantillons, l'analyse des instruments et l'établissement de rapports, ainsi que l'analyse avancée des données. Tous les systèmes logiciels ultérieurs sont basés sur les structures de données du LIMS. Le LIMS a été modifié pour tirer parti et s'interfacer avec des systèmes internes d'extraction d'informations et de visualisation de données, ainsi qu'avec des instruments et des logiciels d'analyse de données de tiers.

Extraction des données et identification des composés

Les données brutes sont extraites, les pics sont identifiés et le CQ est traité à l'aide d'une combinaison de services logiciels développés par Metabolon (applications). Chacun de ces services exécute une tâche spécifique et communique/coordonne avec d'autres services à l'aide de protocoles standardisés.

Les composés sont identifiés par comparaison avec les entrées de la bibliothèque de standards purifiés ou d'entités inconnues récurrentes. Metabolon maintient une bibliothèque basée sur des standards authentifiés qui contient le temps/index de rétention (RI), le rapport masse/charge (m/z) et les données de fragmentation de toutes les molécules présentes dans la bibliothèque. En outre, les identifications biochimiques sont basées sur trois critères : l'indice de rétention dans une fenêtre RI étroite de l'identification proposée, la correspondance précise de la masse avec la bibliothèque +/- 10 ppm, et les scores MS/MS en avant et en arrière entre les données expérimentales et les normes authentiques.

Les scores MS/MS sont basés sur une comparaison des ions présents dans le spectre expérimental avec les ions présents dans le spectre de la bibliothèque. Bien qu'il puisse y avoir des similitudes entre les molécules sur la base de l'un de ces facteurs, l'utilisation des trois points de données permet de distinguer et de différencier les produits biochimiques.

Plus de 5 400 composés standard purifiés ou synthétisés en interne, disponibles dans le commerce, ont été acquis et analysés sur toutes les plates-formes afin de déterminer leurs caractéristiques analytiques. En outre, 7 000 entrées de spectres de masse ont été créées pour des substances biochimiques sans nom structurel, qui ont été identifiées en raison de leur nature récurrente (à la fois chromatographique et spectrale de masse). Ces composés ont le potentiel d'être identifiés par l'acquisition future d'un standard purifié correspondant ou par une analyse structurelle classique.

Contrôle de la qualité des composés

Diverses procédures de curation sont mises en œuvre pour s'assurer qu'un ensemble de données de haute qualité est mis à disposition pour l'analyse statistique et l'interprétation des données. Les processus de CQ et de curation ont été conçus pour garantir l'identification précise et cohérente des véritables entités chimiques et pour supprimer ou corriger celles qui représentent des artefacts du système, des erreurs d'affectation, des erreurs d'intégration et des bruits de fond.

Les analystes de données de Metabolon utilisent un logiciel propriétaire de visualisation et d'interprétation pour confirmer la cohérence de l'identification et de l'intégration des pics entre les différents échantillons.

Quantification des métabolites et normalisation des données

Les pics sont quantifiés en utilisant l'aire sous la courbe. Pour les études s'étendant sur plusieurs jours, une étape de normalisation des données est effectuée pour corriger la variation résultant des différences de réglage des instruments d'un jour à l'autre. Essentiellement, chaque composé est corrigé par blocs de jours d'exécution en enregistrant les médianes pour qu'elles soient égales à un (1,00) et en normalisant chaque point de données proportionnellement (appelée "correction par bloc", voir la figure 2).

Pour les études qui ne nécessitent pas plus d'une journée d'analyse, aucune normalisation n'est nécessaire, si ce n'est celle effectuée à des fins de visualisation des données. Dans certains cas, les données biochimiques peuvent avoir été normalisées en fonction d'un facteur supplémentaire (par exemple, le nombre de cellules, les protéines totales déterminées par le test de Bradford, l'osmolalité, etc.

Figure 2. Visualisation des étapes de normalisation des données pour une plateforme fonctionnant sur plusieurs jours.