Procedimientos experimentales

Plataforma Metabolon

Adhesión de muestras

Tras su recepción, las muestras son inventariadas y almacenadas inmediatamente a -80°C. Cada muestra recibida se registra en el sistema LIMS Metabolon y se le asigna un identificador único asociado únicamente con el identificador original de la fuente. Este identificador se utiliza para rastrear toda la manipulación de muestras, tareas, resultados, etc.

Las muestras (y todas las alícuotas derivadas) son rastreadas por el sistema LIMS utilizando un identificador único cuando se crea una nueva tarea. También se hace un seguimiento de las relaciones entre muestras de padres a hijos. Todas las muestras se mantienen a -80 °C hasta su procesamiento.

Preparación de la muestra

Las muestras se preparan utilizando el sistema automatizado MicroLab STAR® de Hamilton Company. Se añaden varios estándares de recuperación antes del primer paso del proceso de extracción con fines de control de calidad. Para precipitar las proteínas, disociar las moléculas pequeñas unidas a proteínas y recuperar metabolitos químicamente diversos, las muestras se mezclan con metanol con agitación enérgica durante 2 minutos (Glen Mills GenoGrinder 2000) seguida de centrifugación.

El extracto resultante se divide en varias fracciones: dos para el análisis mediante dos métodos distintos de fase inversa (RP)/UPLC-MS/MS con ionización por electrospray (ESI) en modo de iones positivos, una para el análisis mediante RP/UPLC-MS/MS con ESI en modo de iones negativos, y una para el análisis mediante HILIC/UPLC-MS/MS con ESI en modo de iones negativos. Las fracciones restantes se reservan como reserva.

A continuación, las muestras se colocan brevemente en un TurboVap® (Zymark) para eliminar el disolvente orgánico. Los extractos de las muestras se almacenan durante la noche bajo nitrógeno antes de su preparación para el análisis.

Control de calidad

Se analizan varios tipos de controles junto con las muestras experimentales:

• Una muestra matriz combinada generada tomando un pequeño volumen de cada muestra experimental (o alternativamente, el uso de un grupo de plasma humano bien caracterizado) sirve como réplica técnica en todo el conjunto de datos.
• Las muestras de agua extraída sirven como blancos del proceso
• En cada muestra analizada se añade un cóctel de estándares de control de calidad cuidadosamente seleccionados para no interferir en la medición de los compuestos endógenos, lo que permite controlar el rendimiento del instrumento y facilita la alineación cromatográfica.

Todas las muestras de control de calidad y los estándares figuran en las tablas 1 y 2.

La variabilidad del instrumento se determina calculando la desviación estándar relativa (RSD) mediana de los estándares añadidos a cada muestra antes de la inyección en los espectrómetros de masas. La variabilidad global del proceso se determina calculando la RSD mediana de todos los metabolitos endógenos (es decir, los estándares no instrumentales) presentes en el 100% de las muestras de matriz agrupadas. Las muestras experimentales se distribuyen aleatoriamente a lo largo del ciclo de la plataforma con muestras de control de calidad espaciadas uniformemente entre las inyecciones, como se indica en la Figura 1.

Tabla 1: Descripción de las muestras de Metabolon QC

Tabla 2: Metabolon QC Standards

Figura 1. Preparación de réplicas técnicas específicas de cliente. Una pequeña alícuota de cada muestra de cliente (cilindros coloreados) se agrupa para crear una muestra de réplica técnica CMTRX (cilindro multicolor), que luego se inyecta periódicamente a lo largo de la ejecución de la plataforma. La variabilidad entre las sustancias bioquímicas detectadas de forma consistente puede utilizarse para estimar la variabilidad del proceso y de la plataforma.

Cromatografía líquida de ultra alta resolución-Espectroscopia de masas en tándem (UPLC-MS/MS):

Todos los métodos utilizan una cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) ACQUITY de Waters y un espectrómetro de masas Thermo Scientific Q-Exactive de alta resolución/precisión interconectado con una fuente de ionización por electrospray calentado (HESI-II) y un analizador de masas Orbitrap operado a 35.000 masas de resolución (PMID: 32445384).

Los extractos secos de las muestras se reconstituyen en disolventes compatibles con cada uno de los cuatro métodos. Cada disolvente de reconstitución contiene una serie de estándares a concentraciones fijas para asegurar la inyección y la consistencia cromatográfica. Una alícuota se analiza utilizando condiciones de iones positivos ácidos, cromatográficamente optimizadas para compuestos más hidrófilos (PosEarly). En este método, el extracto se eluye en gradiente desde una columna C18 (Waters UPLC BEH C18-2,1×100 mm, 1,7 µm) utilizando agua y metanol con un 0,05% de ácido perfluoropentanoico (PFPA) y un 0,1% de ácido fórmico (FA).

También se analiza una segunda alícuota utilizando condiciones de iones positivos ácidos; sin embargo, esta alícuota está cromatográficamente optimizada para compuestos más hidrófobos (PosLate). En este método, el extracto se eluye en gradiente desde la misma columna C18 de Waters utilizando metanol, acetonitrilo, agua, 0,05% de PFPA y 0,01% de FA, operando a un contenido orgánico más alto.

Una tercera alícuota se analiza en condiciones básicas optimizadas para iones negativos utilizando una columna C18 específica separada (Neg). Los extractos básicos se eluyen de la columna en gradiente utilizando metanol y agua con 6,5 mM de bicarbonato de amonio a pH 8.

Una cuarta alícuota se analiza mediante ionización negativa tras la elución desde una columna HILIC (Waters UPLC BEH Amide 2,1×150 mm, 1,7 µm) utilizando un gradiente consistente en agua y acetonitrilo con 10mM de formiato de amonio, pH 10,8. El análisis MS alterna entre MS y barridos ^MSn dependientes de los datos utilizando exclusión dinámica. El rango de barrido varía ligeramente entre métodos pero cubre 70-1000 m/z. Los archivos de datos brutos se archivan y se extraen como se describe a continuación.

Bioinformática

El sistema informático consta de cuatro componentes principales: el sistema de gestión de información de laboratorio (LIMS), el software de extracción de datos e identificación de picos, las herramientas de procesamiento de datos para el control de calidad y la identificación de compuestos, y una colección de herramientas de interpretación y visualización de la información para uso de los analistas de datos. Las bases de hardware y software para estos componentes informáticos son la red troncal LAN y un servidor de base de datos que ejecuta Oracle 10.2.0.1 Enterprise Edition.

LIMS

El propósito del sistema Metabolon LIMS es permitir la automatización de laboratorios totalmente auditables a través de un sistema seguro, fácil de usar y altamente especializado. El alcance del sistema LIMS de Metabolon abarca el acceso a las muestras, la preparación de las mismas, el análisis de instrumentos y la elaboración de informes, así como el análisis avanzado de datos. Todos los sistemas de software posteriores se basan en las estructuras de datos del LIMS. El LIMS ha sido modificado para aprovechar e interactuar con sistemas internos de extracción de información y visualización de datos, así como con instrumentación y software de análisis de datos de terceros.

Extracción de datos e identificación de compuestos

Los datos brutos se extraen, los picos se identifican y el control de calidad se procesa utilizando una combinación de servicios de software desarrollados por Metabolon (aplicaciones). Cada uno de estos servicios realiza una tarea específica, y se comunican/coordinan con otros servicios utilizando protocolos estándar de la industria.

Los compuestos se identifican por comparación con las entradas de la biblioteca de estándares purificados o entidades desconocidas recurrentes. Metabolon mantiene una biblioteca basada en estándares autentificados que contiene el tiempo/índice de retención (RI), la relación masa/carga (m/z) y los datos de fragmentación de todas las moléculas presentes en la biblioteca. Además, las identificaciones bioquímicas se basan en tres criterios: índice de retención dentro de una estrecha ventana RI de la identificación propuesta, coincidencia de masa exacta con la biblioteca +/- 10 ppm, y las puntuaciones MS/MS forward y reverse entre los datos experimentales y los estándares auténticos.

Las puntuaciones MS/MS se basan en una comparación de los iones presentes en el espectro experimental con los iones presentes en el espectro de la biblioteca. Aunque puede haber similitudes entre las moléculas basadas en uno de estos factores, el uso de los tres puntos de datos se utiliza para distinguir y diferenciar las sustancias bioquímicas.

Se han adquirido y analizado en todas las plataformas más de 5.400 compuestos estándar purificados disponibles en el mercado o sintetizados internamente para determinar sus características analíticas. Se han creado otras 7.000 entradas de espectros de masas para bioquímicos estructuralmente sin nombre, que se han identificado en virtud de su naturaleza recurrente (tanto cromatográfica como de espectros de masas). Estos compuestos tienen el potencial de ser identificados mediante la futura adquisición de un estándar purificado coincidente o mediante el análisis estructural clásico.

Control de calidad de los compuestos

Se llevan a cabo diversos procedimientos de curación para garantizar la disponibilidad de un conjunto de datos de alta calidad para el análisis estadístico y la interpretación de los datos. Los procesos de CC y curación se diseñaron para garantizar una identificación precisa y coherente de las entidades químicas verdaderas, y para eliminar o corregir las que representan artefactos del sistema, asignaciones erróneas, integración incorrecta y ruido de fondo.

Los analistas de datos Metabolon utilizan un software propio de visualización e interpretación para confirmar la coherencia de la identificación e integración de picos entre las distintas muestras.

Cuantificación de metabolitos y normalización de datos

Los picos se cuantifican utilizando el área bajo la curva. En los estudios que abarcan varios días, se realiza un paso de normalización de los datos para corregir la variación resultante de las diferencias de sintonía entre los instrumentos. Esencialmente, cada compuesto se corrige en bloques de días de ejecución registrando las medianas para que sean iguales a uno (1,00) y normalizando cada punto de datos proporcionalmente (lo que se denomina "corrección en bloque", véase la Figura 2).

Para los estudios que no requieren más de un día de análisis, no es necesaria ninguna normalización aparte de la realizada con fines de visualización de los datos. En algunos casos, los datos bioquímicos pueden haberse normalizado a un factor adicional (por ejemplo, recuento de células, proteína total determinada por el ensayo de Bradford, osmolalidad, etc.) para tener en cuenta las diferencias en los niveles de metabolitos debidas a las diferencias en la cantidad de material presente en cada muestra.

Figura 2. Visualización de los pasos de normalización de datos para una ejecución de plataforma de varios días.