Chapitre 4 - Types d'échantillons pour la métabolomique

Métabolites dans le sang

Le sang humain contient des centaines de métabolites qui constituent des outils de diagnostic utiles pour la santé d'une personne. Le prélèvement d'échantillons sanguins peut sembler banal, mais il faut tenir compte de plusieurs éléments importants lors de l'échantillonnage et du traitement des échantillons sanguins :

• Les échantillons de sang peuvent être traités sous forme de plasma ou de sérum. Le plasma et le sérum sont obtenus à partir de la partie liquide du sang, une fois les cellules enlevées. Le sérum est la partie liquide après la coagulation, tandis que le plasma est la partie liquide restant après l'ajout d'un anticoagulant. Les deux types d'échantillons produisent des métabolomes^similaires1, mais certains anticoagulants, tels que l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) ou le^citrate2, peuvent apparaître dans les métabolomes plasmatiques. L'héparine est moins susceptible d'interférer avec les signaux de spectrométrie de masse (SM). Réfléchissez bien au choix de l'anticoagulant à utiliser si vous étudiez le plasma et assurez-vous d'avoir un plan en place pour éliminer le signal de fond pendant l'analyse des données, si nécessaire.
• Éviter à tout prix l'hémolyse. Quel que soit le type de sang prélevé, les chercheurs doivent s'efforcer d'éviter la lyse des globules rouges (GR). Lorsque les GR sont lysés, l'hémoglobine et d'autres composants intracellulaires sont libérés^.3 Ces molécules peuvent interférer avec la quantification par SM d'autres métabolites sanguins^.4
• Conserver les échantillons à -80 °C. Les échantillons doivent être conservés dès que possible à -80 °C après le prélèvement. Ils doivent également être conservés sous forme d'aliquotes dans des tubes séparés afin de minimiser les cycles de congélation-décongélation qui peuvent altérer le métabolome sanguin^.5

Métabolites dans l'urine

L'urine est constituée de molécules hydrosolubles telles que l'urée, les ions, les toxines et d'autres déchets que les reins extraient de la circulation sanguine. L'urine a également un faible nombre de cellules, ce qui réduit le bruit biologique dans le métabolome de l'urine^.6 Les échantillons d'urine sont également faciles à collecter puisqu'ils peuvent être obtenus à la maison ou en laboratoire. Malgré ces avantages, certaines considérations doivent être prises en compte lors du traitement des échantillons d'urine :

• Teneur élevée en sel. Les échantillons d'urine peuvent contenir des concentrations élevées en sel qui induisent la formation d'adduits pendant la SM. La présence de plusieurs adduits peut réduire la sensibilité de la détection des métabolites dans les échantillons^{.7 L} 'extraction des échantillons doit donc éliminer les sels interférents ou leurs signaux doivent être détectés et éliminés lors de l'analyse des données^.8
• La dilution de l'échantillon peut être nécessaire. Certains métabolites très abondants, tels que l'urée, peuvent masquer les signaux MS des métabolites peu abondants. Dans de telles situations, la dilution de l'urine augmentera l'intensité du signal d'autres métabolites dans l'échantillon. Cette étape nécessite toutefois une étape de normalisation pour tenir compte des différences de volume d'urine, de teneur en eau et de densité d'eau avant et après la dilution^.9
• Les échantillons doivent être traités rapidement. Des temps de traitement rapides sont essentiels pour générer des métabolomes urinaires robustes. En effet, les métabolomes urinaires peuvent changer très rapidement, même lorsqu'ils sont conservés à des températures aussi basses que 4°C^.10 Si les échantillons ne peuvent pas être traités rapidement, un stockage à -20°C ou -80°C peut permettre de conserver les métabolomes urinaires avant le traitement.
• Autres considérations. L'élimination des cellules doit être envisagée car les cellules épithéliales peuvent être présentes en faible quantité dans l'urine. En outre, bien que des enzymes puissent être présentes dans l'urine, l'ajout d'un inhibiteur n'est pas recommandé car ils peuvent obscurcir les signaux de SM provenant de molécules endogènes^.11

Métabolites dans les fèces

Les métabolomes fécaux constituent un indicateur utile des activités du microbiome intestinal et de leurs liens avec la santé, le mode de vie et la génétique de l'hôte^.12 Les liens complexes avec la santé digestive et corporelle par le biais de différents axes tels que l'axe ^{intestin-cerveau13} font des métabolomes fécaux un type d'échantillon intéressant à étudier. L'étude des métabolomes fécaux s'accompagne également d'une série de considérations techniques qui affectent vos protocoles de traitement :

• Les matières fécales contiennent différentes classes de biomolécules. Bien que la matière fécale soit composée d'environ 75 % d'eau, elle contient également un large éventail de biomolécules telles que de la matière organique non digérée, de la biomasse bactérienne, des hydrates de carbone, des graisses, des protéines et des gaz organiques.
• Les matières fécales sont très hétérogènes. De nombreux facteurs peuvent avoir un impact sur l'apparence et la composition chimique des matières fécales, notamment l'alimentation, l'état de santé du patient, les médicaments et la génétique de l'hôte14 . Il s'agit notamment de l'alimentation, de l'état de santé du patient, des médicaments et de la génétique de l'hôte^.14 Cela complique les efforts de normalisation des protocoles d'extraction de la matière fécale^.15
• Les échantillons peuvent être conservés à température ambiante. Les échantillons fécaux peuvent être conservés à température ambiante pendant quelques jours avec certains conservateurs. Toutefois, pour une conservation à long terme, les échantillons doivent être conservés à -80°C.

Métabolites dans les tissus

L'étude des métabolomes tissulaires fournit une série d'informations utiles à la recherche biomédicale. Les biopsies de tissus sont utilisées pour diagnostiquer les cancers, étudier la physiologie des organes et surveiller l'état des maladies. Bien que les tissus soient moins complexes que d'autres types d'échantillons, leur traitement à des fins de recherche métabolomique doit également faire l'objet d'une attention particulière :

• Des temps de traitement rapides sont essentiels. Le métabolisme cellulaire se poursuit même après le prélèvement des biopsies^.16 Par conséquent, les échantillons doivent être traités immédiatement ou congelés rapidement dans l'azote liquide afin de conserver le métabolome tissulaire aussi près que possible de l'état in situ^.17 Les échantillons peuvent également être conservés à -80°C avant d'être traités.
• Élimination des contaminants non tissulaires. Les échantillons de tissus peuvent contenir du tissu conjonctif, de la graisse et du sang résiduel qui peuvent obscurcir le métabolome du tissu^.18 Tout protocole d'extraction avec des tissus doit d'abord éliminer ces composants par un rinçage à l'eau désionisée pour éviter toute contamination.
• Les protocoles d'extraction dépendent du type de tissu. Comme c'est le cas pour de nombreux autres types d'échantillons, plusieurs solvants organiques différents ont été utilisés pour traiter les échantillons de tissus en partant du principe que les métabolomes sont non sélectifs et reproductibles. Cependant, chaque type d'échantillon de tissu peut nécessiter des protocoles d'extraction uniques^,15 et bien que des efforts aient été faits pour normaliser ces protocoles, il reste encore beaucoup à faire.

Autres types d'échantillons pour la métabolomique

Bien que les quatre types d'échantillons décrits ci-dessus soient les plus fréquemment étudiés dans la recherche métabolomique, l'analyse métabolomique peut être effectuée sur n'importe quel type d'échantillon, à condition qu'un moyen d'extraire les métabolites ait été mis au point. Parmi les autres types d'échantillons et les considérations relatives à leur traitement, on peut citer

• Milieux de culture : La recherche in vitro est utile pour étudier la physiologie cellulaire, en particulier pour les cellules bactériennes. Lorsqu'ils comparent les métabolomes d'une étude à l'autre, les chercheurs doivent tenir compte des milieux utilisés dans chaque étude. Le choix du milieu peut avoir un impact considérable sur les métabolomes produits par les cellules en croissance^.18
• Sol : le sol est le support de l'écosystème mondial. Stockés dans la matière organique du sol, les métabolites du sol peuvent indiquer le type de sol, les processus biogéochimiques et les effets de l'activité anthropique sur la santé environnementale^.19 Les protocoles typiques d'extraction du sol consistent à fumiger le sol avec des vapeurs de chloroforme pour libérer les métabolites intracellulaires avant d'extraire les métabolites à l'aide de tampons d'extraction à haute teneur en sel^{.20 Le} sol contient également des composés organiques volatils qui nécessitent un protocole d'extraction distinct pour les stabiliser et les caractériser^.21
• L'eau : Des centaines de nouvelles classes de composés sont découvertes dans l'eau, en particulier dans les eaux marines^.22 Cependant, les environnements marins peuvent être très complexes, en fonction des aspects de l'écosystème marin étudié^.23 Si les protocoles d'extraction typiques avec des solvants organiques fonctionnent pour l'eau, ils devront être modifiés en fonction des ensembles de métabolites étudiés.

Quelle est la prochaine étape ?

Maintenant que vous connaissez les éléments à prendre en compte lors de la collecte de différents types d'échantillons pour l'analyse métabolomique, nous allons nous intéresser de plus près à la préparation, au stockage et au transport des échantillons. Le plus grand soin apporté à ces étapes garantira des métabolomes de la plus haute qualité possible afin que vous puissiez extraire des informations exploitables de votre étude.